| 研究課題/領域番号 |
22K06816
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48010:解剖学関連
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
秋元 義弘 杏林大学, 医学部, 特任教授 (60184115)
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| 研究分担者 |
宮東 昭彦 杏林大学, 医学部, 教授 (80255398)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | アクチン / 糖修飾 / リン酸化 / 腎糸球体 / 核内構造体 / 核スペックル / 転写 / O-GlcNAc / 核 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
研究代表者らは、これまでO-グリコシド結合N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)とよばれる糖の修飾（O-GlcNAc化）とリン酸化の変化を指標にして、糖尿病性腎症に伴うアクチンのO-GlcNAc化とリン酸化の変化を明らかにしてきた。この過程で、O-GlcNAc化アクチン並びにリン酸化アクチンが細胞質だけでなく核内にも存在する事実を見出した。核内におけるアクチンは転写調節などの重要な役割を担っていることが報告されているが、糖修飾アクチンおよびリン酸化アクチンの役割についての報告はまだない。本研究では、糖修飾アクチンとリン酸化アクチンの核内での局在およびその役割を解明することを目的にする。
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| 研究実績の概要 |
前年度、リン酸化Ser199アクチンの核内における局在を調べ、糖修飾アクチンの局在と比較する目的で、リン酸化、糖修飾 Ser199アクチン抗体と核内構造体に対するマーカータンパク質抗体を用いて、免疫組織化学的方法によりリン酸化、糖修飾アクチンが核内構造体に局在するかを検討した。その結果、ラット腎糸球体の足細胞およびその培養細胞においてリン酸化Ser199アクチン並びに糖修飾Ser199アクチンが核スペックルに共局在していることが明らかになった。この結果をもとに、糖修飾、リン酸化アクチンの核内での機能（転写への関与）を調べることを目的に、RNAポリメラーゼIIと糖修飾、リン酸化アクチンが共局在しているか免疫染色で調べ、修飾アクチンの転写調節への関与を検討した。その結果、RNAポリメラーゼIIと修飾アクチンとは一部局在が一致していることが明らかになった。このことから、修飾アクチンの転写調節への関与が推測された。
さらに、糖修飾、リン酸化と核内におけるアクチンフィラメント形成阻害との関係を調べることを目的に、糖修飾アクチン抗体、リン酸化アクチン抗体、非修飾抗体を培養細胞の核内に導入することにより、核内にアクチンフィラメントが形成されるかどうかについて光顕、電顕レベルで検討した。その結果、リン酸化アクチン抗体、非修飾抗体を細胞内に導入した場合には、変化がなかったのに対して、糖修飾アクチン抗体を細胞内に導入した細胞の核内にはアクチン線維が形成されることが明らかになった。これらのことからアクチンへの糖修飾は、核内でのアクチン線維形成を阻害することが示唆された。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
当施設に設置されている電子顕微鏡およびCCDカメラが老朽化により、故障がおきて修理に時間がかかったため、
予定通り研究を進めることができなかった。これによって計画より少し遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
糖修飾アクチン、リン酸化アクチンと相互作用する核内タンパク質の同定することを目的に、核画分タンパク質を、修飾アクチン抗体を用いて免疫沈降を行う。そのタンパク質を電気泳動にて分離する。このタンパク質を含むバンドをゲルから切り出し、マススペクトロメトリーにより同定する。これによって同定されたタンパク質から、修飾アクチンの核内での機能について推測する。
培養細胞を糖修飾またはリン酸化阻害剤存在下で培養することにより、アクチンへの修飾を変化させ、核内でアクチンフィラメントが形成されるかを光顕、電顕レベルで検討する。
さらに、リン酸化Ser52アクチンの核内における局在を調べ、糖修飾アクチンの局在と比較する目的で、リン酸化、糖修飾 Ser52アクチン抗体と核内構造体に対するマーカータンパク質抗体を用いて、免疫組織化学的方法により修飾アクチンが核内構造体の局在するかを検討する。
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