| 研究課題/領域番号 |
22K06845
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48020:生理学関連
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
蓑部 悦子 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00448581)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | Cav1.2チャネル / カルモジュリン / 不活性化 / カルシウム / パッチクランプ法 / inside-out recording / pull-down assay / パッチクランプ / inside-out |
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| 研究開始時の研究の概要 |
L型Caチャネル（Cav1.2）は、細胞内のCaの濃度調整に重要であり、筋肉、神経や分泌細胞に分布し、筋収縮、遺伝子発現、シナプス伝達、ホルモン分泌などに関与する。チャネルの活性調節にはカルモジュリン(CaM)が必須であるが、その分子機構は解明されていない。
チャネルの活性とCaMの結合部位との機能的相関を明らかにすることを目的とし、電気生理学的手法を用いて解析を行う。チャネルのC末端切断部にCaMを繋いだ変異体（チャネル‐CaM複合体）を作成し、CaMによる直接作用を明確にする。この複合体にアミノ酸変異を導入、またはN末端領域を切断し、生理的条件下での不活性化の分子機構を追究する。
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| 研究実績の概要 |
Cav1.2チャネルの不活性化は細胞内カルシウム濃度を生理的範囲内に留めることにおいて、重要な働きをしている。この不活性化に必須な因子として、カルシウムセンサー蛋白であるカルモジュリンがある。しかし、その調節機構の解明は十分ではない。これまでに、カルシウム濃度一定の条件下で、カルモジュリン濃度依存的にチャネルの活性が抑制されること、チャネルのアミノ末端に1分子、カルボキシル末端に2分子のカルモジュリンが結合することを報告し、2分子のカルモジュリンによるチャネル不活性化を想定した新規のモデルを提唱した。
本研究では、昨年度に継続して、分子生物学的手法によりチャネルのC末端部にカルモジュリンを繋いだ変異体を用いて、カルシウム依存性の不活性化機構に含まれると考えられるカルモジュリン濃度依存性の不活性化について、結合実験と電気生理学実験によって解析を進めた。
チャネル変異体のカルモジュリン結合部位のうち、アミノ末端1か所とカルボキシル末端５か所にアミノ酸変異を導入し、カルシウム濃度依存性の不活性化とカルモジュリン濃度依存性の不活性化に分けて観察した。また、チャネル変異体のカルボキシル末端ペプチドを大腸菌蛋白発現系を用いて単離精製し、結合実験を行った。
その結果、カルモジュリンは低濃度カルシウム条件下で、IQドメインに結合しており、カルシウム濃度が上がると、2つ目のカルモジュリンがその上流に結合することが示唆された。チャネルの不活性化に関係するカルモジュリンの結合部位は、チャネルのアミノ末端とカルボキシル末端を含む複数の部位の相互作用により安定化することが示唆され、その特定には更なる検討が必要であると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実験結果の解析がおおむね進み、追加で必要な実験の目途が立った。
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| 今後の研究の推進方策 |
新規に作成が必要と判断したチャネル変異体の作成を優先して行う。
主に、電気生理学実験による解析において、不足しているデータを早急に取得し、論文にまとめる。
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