| 研究課題/領域番号 |
22K06847
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48020:生理学関連
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
野村 健 兵庫県立大学, 環境人間学部, 准教授 (10706790)
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| 研究分担者 |
澤田 康之 名古屋大学, 未来社会創造機構, 准教授 (90718355)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 機械受容チャネル / MscL / メカノセンサー / 膜張力 / タンパク質-脂質相互作用 / パッチクランプ / 大腸菌 / 分子動力学シミュレーション / 両親媒性物質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
あらゆる細胞は外界からの機械刺激を感じて応答するが、細胞の機械刺激を感知する分子実体の代表格として機械受容（MS: mechanosensitive）チャネルが知られている。大腸菌にはMscSとMscLと呼ばれるMSチャネルが発現しており、真水などの低張な環境に晒されて菌体が膨張すると活性化閾値の低いMscSから順に開口して水やイオンなどを放出することで細胞の破裂死を防いでいる。しかし、MSチャネルの開閉機構についての詳細は依然として謎が多い。本研究は、機械刺激およびMSチャネルの活性化剤であるクロルプロマジンを用い、その局在による膜張力をどのようにMscLが感知しチャネルを開口へと導くのか、その分子機構を解明することが目的である。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、大腸菌に発現している機械受容チャネルMscL（mechanosensitive channel of large conductance）の野生型および突然変異型を用い、MscLの活性化剤である両親媒性物質クロルプロマジン（CPZ）を細胞膜の内外葉に不均等に分布させた場合、それがどのように膜張力の増加に繋がり、2つのメカノセンサー（F7およびF78）の感度を高めチャネルを開口へと導くのか、その分子メカニズムを解明することを目的とする。研究方法としては、チャネルが開きにくい機能喪失型突然変異体（LOF: loss-of-function mutant）であるF7XおよびF78Xを作成し、細胞膜の内葉、外葉および両葉側からCPZを投与した場合の機械刺激に対する応答をパッチクランプ法を用いて評価する。また、分子動力学シミュレーションを用いた解析結果と電気生理学的実験で得られた結果を比較・照合しMscLのゲーティング機構のモデル構築を目指す。今年度は、昨年度に引き続き、細胞膜の内葉側および外葉側に存在するF7とF78をそれぞれ19種類のアミノ酸残基に置換したMscL突然変異体をそれぞれ作成し、パッチクランプ法を用いて機械刺激感受性の評価（MscL/MscS）を行った。その結果、F7X MscL突然変異体は野生型MscL（1.65±0.11）に比べ高い閾値比（2.57±0.28）を示し、さらにF78X MscL突然変異体の閾値比（1.77±0.17）よりも活性化閾値が高く、F7Xの機械刺激感受性は、F78Xの1.53倍であることが分かった。これらの結果より、MscLの機械刺激感受性は、細胞膜の内葉と外葉で異なることが示唆された。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
今年度は、F7およびF78を19種類のアミノ酸残基にそれぞれ置換した突然変異体の作成に時間を要したが、 パッチクランプ法を用いて各突然変異体の機械刺激感受性を評価することができた。一方、MscLのゲーティング機構の解明するためには、さらに多数の突然変異体の作成が必要であり、当初の予定より進行がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度は、F7XおよびF78X MscL突然変異体を用いた低浸透圧ショック実験、成長曲線の測定、およびウェスタンブロットに法を用いて細胞膜上での発現を確認する。また、MscL チャネルの活性化剤であるクロルプロマジンを用い、細胞膜の外葉に存在する F78 と内葉に存在する F7 の機能的役割を検証する。さらに、電気生理学的実験の結果と分子動力学シミュレーションによる解析結果を比較・照合し、MscL のゲーティング機構のモデル構築を目指す。
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