| 研究課題/領域番号 |
22K06871
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48030:薬理学関連
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
一瀬 千穂 藤田医科大学, 医学部, 准教授 (10247653)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | テトラヒドロビオプテリン / チロシン水酸化酵素 / リン酸化 / 一酸化窒素 / 自律神経 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
テトラヒドロビオプテリン（BH4）は、チロシン水酸化酵素（TH）および一酸化窒素合成酵素(NOS)の活性に必須のコファクターである。このため細胞内のBH4量やその酸化・還元状態、利用効率が変化すると、神経伝達物質であるモノアミンや一酸化窒素（NO）の産生が大きく変化し、神経・精神疾患、循環器疾患、持続勃起症等の発症やその防御機構にかかわる可能性が高い。この研究ではBH4生合成酵素の遺伝子改変マウスを用いて、BH4によってどのようなメカニズムで神経終末のTHのタンパク質量が制御されるのか、BH4を介して自律神経系とNO産生系の間にどのような相互調節が働いているのかを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
（１）テトラヒドロビオプテリン(BH4)を欠損するマウスで生じるチロシン水酸化酵素(TH)たんぱく質の減少がユビキチン化を介するか否かを調べるため、
①野生型マウスとセピアプテリン還元酵素(SPR)遺伝子ノックアウト（Spr-/-）マウスの副腎、線条体、中脳、橋・延髄の組織ライセートを抗TH抗体で免疫沈降し、抗TH抗体と抗ユビキチン抗体で検出する実験を行った。ユビキチン化THと考えられるバンドは検出されなかった。
②野生型マウスとSpr-/-マウスの線条体スライスを作成し、プロテアソーム阻害薬であるMG132の添加及び非添加で3時間培養し、そのライセートを用いてTHのたんぱく質量の変化とユビキチン化の検出を行った。その結果MG132によるTHの分解抑制効果やユビキチン化THは検出されなかった。
③この過程でSpr-/-マウスの副腎のTHのたんぱく質量は野生型と同程度、線条体と中脳のTHはそれぞれ野生型の0.7%, 40%程度であること、Spr-/-マウスの副腎と線条体においてはSer40のリン酸化が亢進していることが確認された。
（２）TH遺伝子の第5-第6エクソンの間と第9-第10エクソンの間にloxPサイトを挿入したマウスと、ヒトドパミンβ-水酸化酵素プロモータ-Cre-ERT2トランスジェニックマウスを交配してThfl/fl マウス、Thfl/fl, Cre-ERT2,マウスを作成した。これらのマウスにタモキシフェン1mgを5日間連続投与した。投与前、投与終了後10日目と1カ月後にTail Cuff法で血圧と心電図を測定した。その後胸大動脈を採取し、フェニレフリンに対する血管収縮とこれに対するアセチルコリン、Sodium Nitroprussideの弛緩反応を比較した。予備的な結果ではあるが、心拍数、心電図の周波数解析、血管反応について顕著な差が認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
In vivoでのTHのユビキチン化を検出するのは難しいと考えられた。
BH4欠損マウスにBH4、L-DOPA（ドパミン前駆物質）、L-threo-DOPS（NE前駆体）、D2およびα2アゴニストを投与し、組織におけるTHのたんぱく質量とリン酸化状態を変化させる条件を探索する実験も進行中であるが、マウス個体を対象としているため時間を擁している。
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| 今後の研究の推進方策 |
BH4生合成の律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼ1（GCH1）遺伝子にloxPサイトを導入したマウスにDBH-CreERT2を導入した誘導破壊マウスを樹立済みである。このマウスで副腎を含むノルアドレナリン細胞特異的にBH4の減少を起こし、THのリン酸化およびたんぱく質量の時間的な変化を検討する。
一方並行してラット褐色細胞腫由来のPC12D細胞より免疫共沈法を用いてTHと相互作用する分子を精製し、LC-MSで同定する。これによりTHの安定化もしくは不安定化にかかわる分子を探索する。
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