| 研究課題/領域番号 |
22K07013
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49030:実験病理学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
坂本 直也 国立研究開発法人国立がん研究センター, 先端医療開発センター, ユニット長 (20571798)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | オルガノイド / 抗がん剤耐性 / 胃がん / 大腸がん / 消化管がん |
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| 研究開始時の研究の概要 |
がん組織が抗がん剤耐性を有する細胞群を生み出すメカニズムの解明を目的とし、Super-enhancerと呼ばれる、細胞の運命決定に大きく寄与するエンハンサー領域の集合体に焦点を当てて解析を行う。抗がん剤耐性を獲得させた消化管がんオルガノイドを用いて、ChIP-sequenceや遺伝子発現解析を行うことで、がんの最小構成単位における抗がん剤耐性細胞へのSuper-enhancerの寄与や、Super-enhancerの活性化に付随して発現する遺伝子の機能を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
オルガノイドはin vitroで幹細胞の維持を可能にし、組織の最小構成単位を培養する手法であり、細胞の分化を確認でき、微小環境の変化に応じた細胞群の形質変化をモデル化できる。
申請者は、がん組織が抗がん剤耐性を有する細胞群を生み出すメカニズムの解明を目的とし、Super-enhancerと呼ばれる、細胞の運命決定に大きく寄与するエンハンサー領域の集合体に焦点を当てて解析を行う。抗がん剤耐性を獲得させた消化管がんオルガノイドを用いて、ChIP-sequenceや遺伝子発現解析を行うことで、がんの最小構成単位における抗がん剤耐性細胞へのSuper-enhancerの寄与や、Super-enhancerの活性化に付随して発現する遺伝子の機能を明らかにする。抗がん剤耐性を有する細胞群を生み出す根本的なメカニズムの詳細の解明は、抗がん剤耐性の克服に貢献する基盤データとして重要な意義があると考える。
本年度は胃がんオルガノイド3例、大腸がんオルガノイド3例における5-FU, オキサリプラチンへの感受性をcell viability assayで検討し、IC50値を算出した。IC50値を基準として、添加する抗がん剤の濃度を複数の条件で検討し、各々のオルガノイドが生存可能な最も高い濃度を同定した。同一サンプルにおいて、生存可能な最高濃度における培養下で継代を続け、IC50の２倍の濃度で培養が維持可能なるまでの維持を続け、それぞれの継代時のサンプルを凍結保存を行った。また比較対象として、胃がん細胞株(MKN-45, MKN-74)、大腸がん細胞株(DLD-1, HT-29)に対しても同様の処理を行い、IC50の算出の後に、継代培養後の凍結サンプルを保存した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画書に記載した研究計画の通り、順調に解析を進めている。
オキサリプラチン添加下での培養では、添加する濃度を少し上げた際に死滅することがあったが、入念な条件検討により、２倍の濃度で生存可能な胃がんオルガノイド3例、大腸がんオルガノイド3例、胃がん細胞株(MKN-45, MKN-74)、大腸がん細胞株(DLD-1, HT-29)の樹立に成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度樹立に成功した胃がん、大腸がんオルガノイドのうち、1回目の継代時、IC50に近い濃度での培養した凍結サンプルを用いて、super-enhancerへの関与が知られているMED1、BRD4抗体を使用してChIP-sequenceを行う。抗がん剤添加下での耐性獲得時に特異的に変化する分子に関し、転写因子を中心として抽出を目指す。中でもenhancerの結合塩基数が非常に長いものがsuper-enhancerに関与している可能性が高く、この項目に焦点を当てて解析対象の絞り込みを行う。
また昨年度樹立した抗がん剤添加下で培養した胃がん、大腸がんオルガノイドのうち、1回目の継代時のIC50に近い濃度での培養したサンプルに対し、ヒストンのアセチル化リジンを認識するブロモドメインの特異的阻害剤であるJQ-1処理下で培養し、抗がん剤耐性獲得への影響に関して検討する。JQ-1処理後に増殖が見られた場合には、RNA sequenceを行い、JQ-1処理の有無による遺伝子発現の変化を比較することで、上記のChIP-sequenceの結果も踏まえて機能的に特異性の高いsuper-enhancerの同定を試みる。
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