サルマラリア原虫接着分子とヒト受容体の結合解析

• 研究課題/領域番号: 22K07043
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分49040:寄生虫学関連
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 坂口 美亜子 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (50400651)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: Plasmodium knowlesi / サルマラリア原虫 / 二日熱マラリア / 接着現象 / Cytoadhesion / 人獣共通感染症

研究開始時の研究の概要

マカク属サルを自然宿主とするマラリア原虫 Plasmodium knowlesi はヒトに二日熱マラリアを引き起こし、時に重篤化や死亡に至る。マラリア原虫寄生赤血球の血管内集積は重篤化に関与すると考えられるため、研究代表者らは本原虫における分子機序の解析を進め、現在までに寄生赤血球のヒト血管内皮細胞への接着現象に関与する P. knowlesi 接着分子を同定した。
そこで、本研究では二日熱マラリアの重篤化に関与する P. knowlesi 寄生赤血球の接着機構を解明するため、P. knowlesi 接着分子が結合するヒト血管内皮細胞の受容体を同定し、分子間の相互作用を解析する。

研究実績の概要

本研究の目的は、二日熱マラリアの重篤化に関与する Plasmodium knowlesi 寄生赤血球の接着機構を解明するため P. knowlesi 接着分子が結合するヒト血管内皮細胞の受容体を同定し、相互作用を解析することである。
まず最初に、これまでにすでに同定している P. knowlesi 接着分子を構成している7つのシステインリッチドメイン（C1-C7）のうち、どのドメイン部位がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に結合するのかを確認するため、いくつかのドメインを除いた短いサイズの接着分子（C1-C4あるいはC4-C7など）を発現する組換え P. knowlesi 原虫の作出を試みた。プラスミド作製のため、部位特異的変異導入による方法でいくつかのドメインを欠失した変異体を取得するためにインバース PCR と酵素処理を行ったが、得られたプラスミドの目的配列の一部が欠失や変異を起こしており、プライマーの変更など条件を変えて繰り返し実験を行ったが目的の正しい配列を得ることができなかった。
そこで、昨年度に上手くいかなかったコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系による組換えタンパク質の作製についてプロトコールの条件設定を検討し直し、溶出の際のバッファー組成や組換えタンパク質の合成の際のスケールなどの修正を行った結果、得られる組換えタンパク質の濃度が上昇し収率が向上した。
現在はこれら作製した組換えタンパク質を用いて HUVEC への結合性を評価するため、Cell ELISA の条件設定を行っているところである。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

最初に P. knowlesi 接着分子の細胞外領域のいくつかのドメインを除いた異なる短い接着分子を発現する組換え原虫を作出するためのプラスミド作製において、様々な条件設定の変更を行ったが正しい配列が得られなかったため、HUVEC に対する結合解析を行うまでには至らなかった。一方、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系による組換えタンパク質の作製方法について変更したところ、得られる組換えタンパク質の収率が改善されたため、これらの組換えタンパク質を HUVEC に対する結合解析やヒト受容体候補群の探索に使用することが可能である。

今後の研究の推進方策

今後の研究の予定として、P. knowlesi 接着分子の細胞外領域のうち短いドメインを含む組換えタンパク質を用いて HUVEC に対する結合解析を行い、 7つのシステインリッチドメインのうちどのドメインが接着に関与するのかを調べる。また、この接着分子を使用して、ヒト血管内皮細胞においてどの受容体が結合できるのかについて評価する。HUVEC と共培養して接着させ、タンパク質架橋剤の濃度や反応時間などの条件検討を行った後、タグに対する抗体を用いて接着分子と HUVEC 受容体を共免疫沈降させる。

研究成果

• [雑誌論文] Effect of geranylated dihydrochalcone from Artocarpus altilis leaves extract on Plasmodium falciparum ultrastructural changes and mitochondrial malate: Quinone oxidoreductase (2023)
  • 著者名/発表者名: Hidayati Agriana Rosmalina、Melinda、Ilmi Hilkatul、Sakura Takaya、Sakaguchi Miako、Ohmori Junko、Hartuti Endah Dwi、Tumewu Lidya、Inaoka Daniel Ken、Tanjung Mulyadi、Yoshida Eri、Tokumasu Fuyuki、Kita Kiyoshi、Mori Mihoko、Dobashi Kazuyuki、Nozaki Tomoyoshi、Syafruddin Din et al.
  • 雑誌名: International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance 巻: 21 ページ: 40-50
  • DOI: 10.1016/j.ijpddr.2022.12.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure and its transformation of elliptical nege-like virus Tanay virus (2023)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Kenta、Song Chihong、Wang Han、Sakaguchi Miako、Chalkiadaki Christina、Miyazaki Naoyuki、Nabeshima Takeshi、Morita Kouichi、Inoue Shingo、Murata Kazuyoshi
  • 雑誌名: Journal of General Virology 巻: 104 号: 6 ページ: 1863-1863
  • DOI: 10.1099/jgv.0.001863
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Peritumoral SPARC expression induced by exosomes from nasopharyngeal carcinoma infected Epstein‐Barr virus: A poor prognostic marker (2023)
  • 著者名/発表者名: Dochi Hirotomo, Kondo Satoru, Komura Shigetaka, Moriyama‐Kita Makiko, Komori Takeshi, Nanbo Asuka, Sakaguchi Miako, Fukuyo Masaki, Hamabe‐Horiike Toshihide, Tanaka Mariko, Mizokami Harue, Kano Makoto, Kitagawa Yuki, Kobayashi Eiji, Hirai Nobuyuki, Ueno Takayoshi, Nakanishi Yosuke, et. al.
  • 雑誌名: International Journal of Cancer 巻: 154 号: 5 ページ: 895-911
  • DOI: 10.1002/ijc.34777
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of surfactin as an anti-severe fever with thrombocytopenia syndrome virus multi-target compound extracted from the culture broth of marine microbes (2023)
  • 著者名/発表者名: Urata Shuzo、Takouda Jun、Watanabe Yoshihiro、Sakaguchi Miako、Sakurai Yasuteru、Inahashi Yuki、Iwatsuki Masato、Yasuda Jiro、Tanaka Yoshimasa、Takeda Kohsuke
  • 雑誌名: Frontiers in Virology 巻: 2 ページ: 1064265-1064265
  • DOI: 10.3389/fviro.2022.1064265
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Chuang Huai、Sakaguchi Miako、Lucky Amuza Byaruhanga、Yamagishi Junya、Katakai Yuko、Kawai Satoru、Kaneko Osamu
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 号: 1 ページ: 14942-14942
  • DOI: 10.1038/s41598-022-19199-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of an imaging system for visualization of Ebola virus glycoprotein throughout the viral lifecycle (2022)
  • 著者名/発表者名: Furuyama Wakako、Sakaguchi Miako、Yamada Kento、Nanbo Asuka
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 13 ページ: 1026644-1026644
  • DOI: 10.3389/fmicb.2022.1026644
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Development of a system to evaluate the expression of exogenously introduced molecules on the surface of infected red blood cells by Plasmodium knowlesi (2024)
  • 著者名/発表者名: Yuka Appelboom, Huai Chuang, Yuko Katakai, Satoru Kawai, Miako Sakaguchi, Osamu Kaneko
  • 学会等名: 第93回日本寄生虫学会合同大会
• [学会発表] Development of a system to evaluate the expression of exogenously introduced molecules on the surface of infected red blood cells by Plasmodium knowlesi (2023)
  • 著者名/発表者名: Yuka Appelboom, Huai Chuang, Yuko Katakai, Satoru Kawai, Miako Sakaguchi, Osamu Kaneko
  • 学会等名: The 21st Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会
• [学会発表] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells. (2022)
  • 著者名/発表者名: Chuang H, Sakaguchi M, Lucky BA, Yamagishi J, Katakai Y, Kawai S, Kaneko O.
  • 学会等名: The 20th Awaji International Forum on Infection and Immunity.
  • 国際学会
• [学会発表] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells. (2022)
  • 著者名/発表者名: Chuang H, Sakaguchi M, Lucky BA, Yamagishi J, Katakai Y, Kawai S, Kaneko O.
  • 学会等名: The 71st Annual Meeting of American Society of Tropical Medicine and Hygiene.
  • 国際学会