| 研究課題/領域番号 |
22K07046
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49040:寄生虫学関連
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| 研究機関 | 神戸常盤大学 |
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研究代表者 |
鈴木 高史 神戸常盤大学, 保健科学部, 教授 (70305530)
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| 研究分担者 |
溝越 祐志 神戸常盤大学, 保健科学部, 講師 (50736163)
川田 均 長崎大学, 熱帯医学研究所, 客員研究員 (80363480)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2024年度: 260千円 (直接経費: 200千円、間接経費: 60千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
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| キーワード | 電位感受性ナトリウムチャネル / 培養細胞 / 疾病媒介蚊 / 発現 / ピレスロイド剤 / 変異 / 電位感受性Na+チャンネル |
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| 研究開始時の研究の概要 |
疾病媒介蚊の電位感受性Na+チャンネル分子に変異が入ることにより、殺虫剤ピレスロイドの効果が大幅に減少している状況が世界各地で報告されている。このため新規殺虫成分の探索は緊急性の高い課題であるが、これを迅速に行うシステムは存在しない。そこで、種々の変異型電位感受性Na+チャンネル分子をCHO-K1細胞ゲノムに導入し、チャンネル分子のプロファイル解析システムの構築を行う。本システムを用いて、Na+チャンネル分子の変異によるピレスロイド剤に対する感受性変化と、同変異を有する飼育蚊のピレスロイド剤への感受性変化との比較・相関解析を行い、蚊を用いない新規in vitro殺虫成分スクリーニングシステムを確立する。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は疾病媒介蚊の電位感受性Na+チャンネル（VSSC)分子のプロファイルをin vitro培養細胞で解析可能なシステムを構築し、これ用いてNa+チャンネル分子の各種変異導入によるピレスロイド剤に対する感受性変化と、同変異を有する蚊のピレスロイド剤への抵抗性変化との比較・相関解析を行うことにより、蚊を用いない簡便かつ迅速な新規in vitro殺虫成分スクリーニングシステムの基盤確立を行うことである。
昨年度までに、CHO-K1細胞に簡便かつ効率的にVSSC分子を導入するシステムの構築を行った。さらに本システムを用いてPA-tag融合VSSC分子発現細胞の構築を行った。また抗PA-tag抗体を用いてPA-tag融合VSSC分子の蛋白レベルでの発現を確認した後に、本細胞を用いてPA-tag融合VSSC分子の機能解析を行ったが、本分子由来の電流が安定して計測できなかった。
そこで本年度はVSSC分子の構造支持部位であるβサブユニット遺伝子を変換し、新たなβサブユニット遺伝子の配列をP2A配列でαサブユニット（機能部位）遺伝子の配列に繋いだ発現コンストラクトを作製した。本コンストラクトを用いて、PA-tag融合VSSC分子（αサブユニット、βサブユニット）発現細胞の構築を行った。本細胞のNa+取り込み機能の解析を、Na+指示薬と蛍光顕微鏡を用いて行ったところ、細胞ごとにNa+取り込み機能に差がみられた。ウェスタンブロット解析の結果、機能を有すると考えられた細胞では、βサブユニット分子の発現が高い傾向がみられた。このことからVSSC分子由来の電流を解析するためには、βサブユニット分子の発現量を増加させる必要性・方向性が考えられた。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
4: 遅れている
理由
疾病媒介蚊の電位感受性Na+チャンネル分子を培養細胞で発現するにあたり、培養細胞の検討、簡便で効率的な遺伝子導入システムの構築、テトラサイクリン発現誘導システムの構築、本分子のタンパクレベルでの発現確認を行ってきた。しかし、本分子による電流が安定しない（生理学的機能を持つように発現ができていない）ため、次の解析システムの構築まで進めていない状況であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の結果で、βサブユニットの発現量を安定して増加させることが、疾病媒介蚊の電位感受性Na+チャンネル分子による電流を安定して計測できることにつながる可能性が示唆された。P2A配列の後に繋いだ遺伝子の発現量が減少してしまうため、α分子とβ分子をゲノム上の別々の領域に導入するシステムを構築することにより、VSSC分子由来の電流を安定的に計測できるマテリアルの構築、電流を簡便に測定できるシステムの構築を進めていく。
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