| 研究課題/領域番号 |
22K07052
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
久留島 潤 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50636488)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2025年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2024年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 腸球菌 / 薬剤耐性 / プラスミド / 接合伝達 / レポーター / イメージング / 細菌感染症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
複数の抗菌薬に高度な耐性を示す多剤抗菌薬耐性菌による感染症は、「静かなパンデミック」と呼ばれ世界的に懸念されている。本研究では、薬剤耐性を付与する遺伝子が接合伝達性プラスミドを介して細菌種間を伝播する仕組みについて基礎的な研究を行う。具体的には、細菌自身の細胞の細胞分裂や染色体ゲノムの複製と薬剤耐性プラスミドとの協調的制御機構に必要な因子を網羅的に同定し、それらの時空間動態を定量的イメージング法によって分析する。本研究の成果から、細菌の進化に関する基礎生物学的な知見が得られるとともに、薬剤耐性菌の新規制御法の創出に向けた分岐基盤となることが期待される。
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| 研究実績の概要 |
腸球菌（Enterococcus spp.）流行株の間で拡散している薬剤耐性プラスミドの動態を解析するための技術的基盤の整備を行なった。特にこれまで効率的な遺伝子組み換え技術がなかったEnterococcus faeciumにおいて効率的にmarker-lessのallele exchangeを行う組換え系の構築に成功した。この組換えでは従来でも用いられてきた温度感受性プラスミドが基盤となるが、本研究においてネガティブセレクション遺伝子を導入することにより、second crossing overが生じたクローンを選択することができ、大幅に実験期間ならびにスクリーニングのサイズを縮小することができた。また、外来的遺伝子発現カセットの最適化を行なった。腸球菌のRNA-seqデータより様々な発現強度を示すプロモーターを選択し、lacI遺伝子上流にクローン化した。一方、lacO配列を含むIPTG誘導性プロモーター下流に、蛍光レポーター遺伝子あるいは発光レポーター遺伝子をクローン化し、各カセットの発現制御を解析した。これまでに、非誘導時のベースラインが極めて低いものや、発現誘導時に高い発現レベルを達成できるものなど、使徒に応じて選択できる誘導系のコレクションが取得できた。一方、顕微鏡観察を用いた観察の結果、抗生物質などの外因的な選択圧によって選択ゲノムから独立して複製・維持されるシャトルベクターを用いた場合、上述の遺伝子カセットの発現が極めて不均一で、表現型の解析には不適であることが明らかになった。一方、染色体や大型プラスミドを含むゲノムへの発現導入では、外来的な選択圧を要することなく均一で安定な遺伝子カセットが導入されることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝学的技術の整備は進捗があるものの、未だ最適化の余地がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
より効率の良い遺伝子組み換え系として、改変した接合伝達プラスミドを利用した技術の開発を試みる。これによって、これまで数週間を要していた遺伝子組み換えが最短で1週間以内に完了できる。構築した遺伝子発現系を利用して、各種レポーター株の構築にとりかかる。また、各種オミクスによる網羅的な関連因子の探索を実施する予定である。
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