| 研究課題/領域番号 |
22K07055
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 大阪公立大学 |
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研究代表者 |
幸田 知子 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 講師 (80336809)
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| 研究分担者 |
片平 じゅん 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 准教授 (30263312)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | ボツリヌス毒素 / 完全ヒト化ボツリヌス神経毒素抗体 / ボツリヌス神経毒素 / モノクローナル抗体 / ボツリヌス毒素抗体 / 抗体医薬品 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
致死性の疾患であるボツリヌス症の治療には、現在、ウマ抗毒素が唯一の効果的な治療薬として用いられている。しかし、異種動物の血清投与には常に一定のリスクを伴い、均一な抗毒素製剤の安定的な供給体制の維持は、非常に困難である。本申請研究では、既存のウマ抗毒素に替わるヒト抗ボツリヌス毒素抗体カクテル製剤の安定な供給体制構築のため、申請者らが樹立した抗ボツリヌスE型毒素ヒト型モノクローナル抗体のユニークな毒素活性中和機構を明らかにし、毒素‐抗体複合体モデルの構造情報をもとに、抗体遺伝子を改変し、A、B、F型毒素を中和するヒト型モノクローナル抗体パネルを開発する。
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| 研究実績の概要 |
完全ヒト抗ボツリヌスE型神経毒素（BoNT/E）モノクローナル抗体hmE9-4は、BoNT/Eの亜鉛依存性プロテアーゼ活性を担う軽鎖ドメイン（L/E）を認識し、単独かつ低用量で抗BoNT/E中和活性をもつ。本研究では、hmE9-4のエピトープを明らかにすることにより、hmE9-4のBoNT/E中和機構の解明することとともに、hmE9-4のパラトープの情報を基に、現在ボツリヌス症の治療に用いられているウマ抗毒素（抗A, BおよびE型BoNTカクテル）に代わるヒト化モノクローナル抗体パネルを作製することを目的とした。
亜鉛結合モチーフの点変異体をはじめとする複数のリコンビナントL/Eを発現・精製し、これらを抗原としたELISAを行った。亜鉛結合モチーフの点変異体とhmE9-4の結合活性は低下しなかったことから、hmE9-4のエピトープは、亜鉛結合モチーフとは異なる領域であり、L/Eのプロテアーゼ活性には影響を与えないことが予想された。またL/EとhmE9-4の共結晶構造解析により、hmE9-4は、L/Eの280-320のループ領域を認識していることを見出した。hmE9-4のエピトープは、基質認識や切断部位とは、空間的に大きく異なっていた。hmE9-4は、軽鎖のサイトゾルへの移行を阻害していることが示唆された。
L/EとhmE9-4の共結晶構造解析から得られたエピトープの情報は、軽鎖のサイトゾル移行機構解明のための有力なツールとなるとともに、パラトープの情報から、hmE9-4の可変領域を改変し、BoNT/E以外のA, B, およびF型BoNTに対する中和抗体の開発につなげる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
hmE9-4のエピトープ領域が明らかになったことから、hmE9-4のBoNT/E中和機構を解明するために、構造情報に基づいた点変異を導入したL/EおよびBoNT/E変異体を発現・精製した。L/EおよびBoNT/E変異体のin vitroでの基質切断活性および細胞内基質切断活性とマウスバイオアッセイにより、それぞれの毒性を評価している。
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| 今後の研究の推進方策 |
hmE9-4のエピトープと パラトープのアミノ酸レベルまで同定する。E型以外のヒトのボツリヌス症を引き起こすA, BおよびF型各軽鎖ドメインにhmE9-4のエピトープに相当するアミノ酸残基の点変異を導入し、発現・精製する。当研究室保存のA, BおよびF型各mAbとの結合をELISAでスクリーニングするとともに、BoNT活性中和能を調べる。有用なmAbについては、可変領域のシークエンスを解析し、ヒト化ボツリヌスｍAbカクテルの候補とする。またこれらのmAbを用いたBoNTの毒素中和機構の解明も行う。
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