| 研究課題/領域番号 |
22K07057
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
相根 義昌 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (00624660)
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| 研究分担者 |
宮下 慎一郎 東京農業大学, 生物産業学部, 助教 (20883292)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | ボツリヌス菌 / 血球凝集素 / 一次構造解析 / ボツリヌス毒素 / 変異 / ムチン / ボツリヌス食中毒 / 経口毒素 / ドラッグデリバリー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ボツリヌス食中毒の発症過程において、食品とともに摂取されたボツリヌス毒素複合体（TC）は、消化管で分解されることなく小腸を通じて、体内に侵入する。TCは、毒性を有する神経毒素（BoNT）が4種の無毒タンパク質から構成された無毒タンパク質複合体（NC）と結合して形成される。先に、我々は、5種のTC構成成分のうち、HA-33にのみ変異を有する菌株を見出し、本菌由来のTCが標準的な菌株のそれと比較し、マウスに対する経口毒性が数十倍高くなることを示した。本研究では、変異株および標準株を用いて、TCの経口毒性の上昇に決定的な影響を与える構成成分とその分子内領域を特定することを目的としている。
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| 研究実績の概要 |
ボツリヌス食中毒を引き起こすボツリヌス神経毒素（BoNT）は、Clostridium botulinumによって産生される。BoNTは、非毒非血球凝集素と血球凝集素（HA）の複合体（HA-33、HA-17およびHA-70から構成される）が会合したProgenitor Toxin Complex（PTC）を形成する。PTCは純粋なBoNTよりも高い経口毒性を示すため、PTCの形成は経口毒性を発揮する上で重要な機能を有するものと推測されている。我々は、ボツリヌスC型菌Yoichi株が産生するPTC（33vPTC）を構成するHA-33は、同じC型菌の参照株が産生するPTC（wtPTC）のそれと比較し、C末端側領域において複数のアミノ酸残基の置換が生じていることを明らかにした。さらに、昨年度の研究で33vPTCはwtPTCよりも90倍経口毒性が高いことを示した。一方で、先の報告において、33vPTC由来HA-33のC末端アミノ酸配列分析により、C末端領域に31アミノ酸残基の欠落が生じている可能性を示した（2002年）。そこで、本年度は大腸菌を用いて変異体HA-33の作製を試みた。しかし、C末端の欠落したタンパク質は不安定であったことから、C末端領域のアミノ酸残基の欠落の有無に疑問が残った。本研究では、改めて先の報告とは異なる手法で33vPTC由来HA-33の一次構造解析を行なった結果、欠落すると考えられていた領域の断片がHA-33標品に存在すること、にもかかわらず、SDS-PAGEにおける移動度が推定されるそれよりも顕著に小さくなることを見出した。以上の結果は、33vPTCを構成するHA-33にはアミノ酸の欠落はないことを示した。さらに、33vPTC由来HA-33の組み換えタンパク質の作製にも成功した。この結果をもとに、wtPTC由来HA-33との機能性比較が行えるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
組換えタンパク質によるHA-33の作製が可能になったことにより、次項で示す今後の研究につなげることができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究によって作製した33vPTCおよびwtPTC由来HA-33の糖に対する結合親和性を測定比較するとともに、糖鎖との結合に関わると考えられるアミノ酸に変異を入れた組換えタンパク質を作製し、それぞれのHA-33と糖との結合に関わるアミノ酸の特定を行い、HA-33と細胞との結合様式を明らかにする。
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