| 研究課題/領域番号 |
22K07062
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
小泉 信夫 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10333361)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | レプトスピラ / レプトスピラ症 / 人獣共通感染症 / 持続感染 / 遺伝子発現 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では，腎臓に定着できないσ70ファミリーシグマ因子遺伝子およびホスファターゼ遺伝子変異体（トランスポゾン挿入変異体）のラット体内での遺伝子発現を野生株と比較し，発現変動のある遺伝子を同定する．同定された遺伝子のノックアウト株を作製し，ラットへの感染性を確認するとともに，in vitroでの各種実験を通して，宿主における持続感染に必須なレプトスピラ遺伝子ネットワークを読み解く．
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| 研究実績の概要 |
人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは，ラットなどの宿主動物の腎臓に持続感染しているが，持続感染の成立に必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない．本研究では，遺伝子発現調節や生理的プロセス制御に関わるシグマ因子遺伝子およびホスファターゼ遺伝子のトランスポゾン挿入変異体において，感染時に発現変動がみられる遺伝子・リン酸化の変動がみられるタンパク質をコードする遺伝子のノックアウト株を作製して感染性を明らかにし，各種のin vitro実験を行いそれら遺伝子産物の機能を明らかにすることで，宿主持続感染に必須のレプトスピラ遺伝子ネットワークを読み解くことを目的とする．
各変異体を同数のコントロール株とともにラットWKAH/Hkmメス6週齢に腹腔内接種し，３日後に採血し血液を希釈してEMJHプレート培養を行ったところ，両変異体とも純培養ではなくコンタミネーションしていうことが明らかとなった．そのため，変異体のストックをプレート培養および限界希釈法によって目的とする変異体のクローニングを行い，限界希釈法によって両変異体の純培養を得ることができた．これら変異体のトランスポゾン挿入位置をターゲットとして，変異体およびコントロール株のリアルタイムPCRによるゲノム定量試験系を確立した．またin vitroでの増殖速度を調査した結果，変異株の増殖速度はコントロール株と変わらないことが明らかとなった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
解析を行う予定だった変異体が純培養ではなくコンタミネーションしていることが明らかとなり，クローニングおよび動物実験を行うための基礎データを取り直すのに時間を要してしまった．
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| 今後の研究の推進方策 |
トランスポゾン挿入変異体培養液を透析チューブに入れ，これをラットWKAH/Hkm腹腔内に移植する1．経時的に透析チューブを回収し，レプトスピラからRNAを抽出，rRNA除去後にcDNAライブラリーを作製して次世代シーケンサー（MiSeq）により解読する（RNA-seq）．得られた配列を参照ゲノムへのアライメントを通して，野生株と変異株で発現変動のある遺伝子を同定する．
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