| 研究課題/領域番号 |
22K07090
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49060:ウイルス学関連
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| 研究機関 | 東北医科薬科大学 |
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研究代表者 |
神田 輝 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (50333472)
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| 研究分担者 |
北村 大志 東北医科薬科大学, 医学部, 助教 (20706949)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | EBウイルス / 複製コンパートメント / RNAポリメラーゼII / BcRF1 / 転写 / 複製 / 基本転写因子 / 遺伝子発現制御 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒト腫瘍ウイルスであるEBウイルスは、細胞に感染した後いったん潜伏感染状態となる。その後、感染細胞に様々なウイルス産生刺激が加わることで子孫ウイルスを産生する。効率の良いウイルス産生のために、ウイルスは自前の基本転写因子群を利用して、「後期遺伝子」がコードするウイルス粒子の構造蛋白質を効率良く発現する。本研究では、ウイルスが自前で持つ基本転写因子群の一つ、viral TATT binding protein (以下vTBP)に注目し、ウイルス産生細胞におけるvTBPの細胞核内局在を解析することで、子孫ウイルスを効率よく産生するための仕組みを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ウイルスの後期遺伝子の発現機構の解析を通じて、細胞の違いによるウイルス産生効率の違いの要因について明らかにすることを目的として研究を行っている。
昨年度の研究により、B95-8細胞にBZLF1遺伝子（ウイルス産生感染のスイッチ遺伝子）を誘導発現することで細胞核内に子孫ウイルス産生の場である「複製コンパートメント」が効率よく形成されるシステムを確立した。そこでこのシステムを用いて、宿主の遺伝子転写を行うRNAポリメラーゼII(RNAPII)の局在と、ウイルスの複製コンパートメントとの関係を調べた。その結果、ウイルス産生が行われていない細胞核では宿主RNAPIIが宿主クロマチン上に局在するのに対して、複製コンパートメントが形成された細胞核内では宿主RNAPIIの大部分が複製コンパートメントに移動・集積することを見出した。RNAPIIは転写開始から伸長過程に移行すると、そのC末端領域(CTD)のリン酸化部位が変化することが知られている。そこでCTDの部位特異的リン酸化抗体を用いてRNAPIIの局在を調べた結果、複製コンパートメントにはCTDの特定部位がリン酸化したRNAPIIが強く集積していることを見出した。
またウイルスの後期遺伝子発現制御にかかわるウイルス遺伝子産物BcRF1（viral TATA-binding protein, vTBP）の解析も進めている。昨年度の研究により、従来使用してきたウイルスのBcRF1蛋白質に対する抗体の特異性に問題があることが判明したため、新たにBcRF1特異的抗血清を作成した。得られた抗血清により、強制発現したBcRF1タンパク質をウェスタン法で検出可能であった。今後、BcRF1の細胞内局在解析へと応用する。
また研究分担者は、EBウイルス株の地域差に着目し、EBウイルス臨床株について、本研究と密接に関連するウイルス遺伝子の塩基配列決定を行った。その結果、東アジア地域のEBウイルス株の特徴を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
子孫ウイルス産生の場である複製コンパートメント形成を効率よく観察できるB95-8細胞はマーモセット由来の不死化Bリンパ球細胞株（リンパ芽球様細胞株）である。この細胞はEBウイルス依存性に増殖する細胞であり、この細胞に感染しているEBウイルスゲノムを細胞内で改変し、改変した組換えウイルスを産生する細胞に転換する技術は未だ確立されていない。そのため新たな組換えEBウイルス産生細胞を効率よく作成可能な細胞は現時点ではHEK293細胞に限定されている。しかしながら、そのHEK293細胞で複製コンパートメント形成を効率よく観察する実験系が確立できていない。またウイルス蛋白質BcRF1の細胞内局在解析を行うために必要な抗血清の取得に時間を要したため、その後の解析に遅れが出ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ウイルス産生のスイッチ遺伝子であるBZLF1遺伝子誘導発現B95-8細胞を用いてウイルス蛋白質の複製コンパートメントへの集積を調べる過程で、別の初期遺伝子産物を認識する抗血清を用いて複製コンパートメントを容易に検出できることを見出した。そこでこの遺伝子産物に対する抗血清を用いた解析を進めつつ、新たに取得したBcRF1に対する抗血清の有用性を検討する。また同じ実験系において、RNAPIIの部位特異的CTDリン酸化抗体とウイルス遺伝子産物に対する抗血清を用いた多重染色により、複製コンパートメントにおけるRNAPIIのCTDリン酸化状態の詳細を解析する。またEBウイルス産生HEK293細胞におけるウイルス産生効率を改良する試みを継続する。そしてB95-8細胞とHEK293細胞の間で複製コンパートメント形成効率、および後期遺伝子発現効率の違いが生じる原因を追究する。
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