新規ロタウイルス分離株に基づく病原性および抗原性の解析

• 研究課題/領域番号: 22K07095
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分49060:ウイルス学関連
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 藤井 克樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (40518122)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: ロタウイルス / ウイルス分離 / MA104細胞 / 回転培養 / 蛍光抗体法 / 病原性 / 抗原性

研究開始時の研究の概要

本研究はロタウイルス（RV）の病原性および抗原性（抗体の交差反応性）の解析を行うものである。RVには多数の遺伝子型（≒血清型）が存在し、特に近年はこれまでに無かった新規流行株が続々と発生している。本研究では、新たに臨床検体から培養細胞にてウイルス分離を行い、近年の主要なRV流行株のライブラリを構築する。そして、これらの株間の病原性および抗原性の違いについて比較解析を行う。

研究実績の概要

2年度目は初年度から引き続き、臨床検体（便）検体からロタウイルス（RV）の分離を試みた。初年度の結果を踏まえてMA104-N*V（回転培養）の条件で分離・継代を実施したところ、国内の主要流行株であるG1P[8](Wa)、G1P[8]-E2、G1P[8](DS-1)、G2P[4]、G3P[8](Wa)、G3P[8](DS-1) 、G8P[8]、G9P[8] (lineage 3)、G9P[8] (lineage 6)、G9P[8]-E2、G12P[8]およびAU-1-like G3P[9]の計12種類のRV株の分離に成功した。続いて、これらの株の大量培養および超遠心法（スクロースクッション法および塩化セシウム密度勾配遠心法）による精製・濃縮を試みた。塩化セシウム密度勾配遠心法で得られるRVの完全ウイルス粒子（TLP：Triple-Layered Particle）の収量は株や培養条件によって大きく異なり、安定的な回収方法の確立は今後の課題と考えられた。続いて、これらの株の力価測定法として、96ウェルプレートを用いた蛍光抗体法による検出方法の検証をおこなった。細胞はMA104-WTおよびMA104-N*V、検出には市販の抗VP6モノクローナル抗体、測定にはセルイメージングシステム（Operetta）を使用した。この方法によりいずれのウイルス株も検出可能であったが、ヒトRV株はMA104細胞への感染効率が低く、抗体価測定用の抗原として使用するためには、高濃度に濃縮したウイルス液の調製が重要になると考えられた。今後の解析に必要なウイルス株は概ね分離できたものの、ウイルスの検出・測定法の改良が課題である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2年度目までの研究で、ヒトRVの効率的な分離・継代条件（MA104-N*V細胞を用いた回転培養）により、国内の主要流行株のほとんどを分離・継代することに成功した。これにより確立されたウイルス株ライブラリは、今後のRV研究において非常に重要な財産になると考えられる。新たな課題として、更なる高濃度のウイルス液を得るために、超遠心による精製・濃縮方法を検証する必要が生じているが、今後はこれらの課題に取り組みつつ、現時点で可能な解析方法により、ウイルス株間の感染効率や病原性、抗原性の違いについて検証を進める予定である。これは当初の予定とおおむね同等以上の進捗状況である。

今後の研究の推進方策

これまでの研究により、MA104-N*V細胞を用いた回転培養により、ヒトRVの増殖が効率化されることが明らかになった。しかし、中和試験等に用いる抗原ウイルスとしては、より高濃度のウイルス液を作製した方が試験に供与しやすいため、培養条件や精製・濃縮方法の更なる改良が望まれる。これまでの傾向から、RVは高いMOIで感染させることにより増殖効率が高く維持されることが示唆されているため、MOIを一定以上に保った継代方法を心掛けることが重要と考えられる。またノロウイルスの培養細胞における増殖を促進させることで知られる胆汁酸が、RVにも有効である可能性があるため、胆汁酸等の添加物によってRVの感染率や増殖効率が向上するか検討する予定である。これは蛍光抗体法による検出感度向上にもつながることが期待される。

研究成果

• [国際共同研究] Stanford University(米国)
• [国際共同研究] University of Nottingham(英国)
• [雑誌論文] 総説 ロタウイルス流行株の変遷 (2023)
  • 著者名/発表者名: 藤井克樹
  • 雑誌名: ウイルス 巻: 73 ページ: 33-44
• [雑誌論文] Complete genome analyses of G12P[8] rotavirus strains from hospitalized children in Surabaya, Indonesia, 2017-2018 (2023)
  • 著者名/発表者名: Laura Navika Yamani, Takako Utsumi, Yen Hai Doan, Yoshiki Fujii, Zayyin Dinana, Rury Mega Wahyuni, Emily Gunawan, Soegeng Soegijanto, Alpha Fardah Athiyyah, Subijanto Marto Sudarmo, Reza Gunadi Ranuh, Andy Darma, Soetjipto, Juniastuti, Rheza Gandi Bawono, Chieko Matsui, Lin Deng, etc.
  • 雑誌名: Journal of Medical Virology 巻: 95 号: 2
  • DOI: 10.1002/jmv.28485
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Isolation and Genome Sequencing of Hepatitis E Virus Genotype 1 Imported from India to Japan (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Sakura、Mori Ai、Sugiyama Ryuichi、Li Tian-Cheng、Fujii Yoshiki、Yato Keigo、Matsuda Mami、Shiota Tomoyuki、Katsumata Masaya、Iwamoto Tomotada、Muramatsu Masamichi、Suzuki Ryosuke
  • 雑誌名: Japanese Journal of Infectious Diseases 巻: 75 号: 6 ページ: 604-607
  • DOI: 10.7883/yoken.JJID.2022.127
  • ISSN: 1344-6304, 1884-2836
  • 年月日: 2022-11-30
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 北海道におけるG1型ロタウイルス流行株の変遷 (2023)
  • 著者名/発表者名: 藤井克樹、福田裕也、足立周平、本庄紗帆、赤根祐介、近藤謙次、中田修二、藤林伸助、津川毅
  • 学会等名: 第27回日本ワクチン学会 第64回日本臨床ウイルス学会 合同学術集会
• [学会発表] ヒトノロウイルス増殖を阻害する生薬エキスの探索 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林豪士, 村上耕介, 藤井克樹
  • 学会等名: 第27回日本ワクチン学会 第64回日本臨床ウイルス学会 合同学術集会
• [学会発表] 多彩な合併症を呈して入院したアストロウイルス性胃腸炎の5例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 健, 滝島 茂, 高澤 啓, 磯田 健志, 岡 智一郎, 染谷 雄一, 藤井 克樹, 村上 耕介, 長谷川 毅, 村松 正道, 森尾 友宏
  • 学会等名: 第55回日本小児感染症学会学術集会
• [学会発表] 遺伝子ノックアウト腸管オルガノイドを用いたヒトノロウイルス感染を規定する宿主因子の解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林豪士、村上耕介、平野順紀、松田麻未、藤井克樹、小林さくら、上野小百合、鈴木亮介、村松正道
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 乳幼児のウイルス性胃腸炎に関する分子疫学的研究（第一報） (2023)
  • 著者名/発表者名: 佐藤健、滝島茂、村山哲、田中里奈、中溝智也、佐藤薫、松田希、石橋奈保子、高澤啓、岡智一郎、染谷雄一、藤井克樹、村上耕介、長谷川毅、村松正道、森尾友宏
  • 学会等名: 第126回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] 新規NSP4モノリアソータントG1P[8]-E2ロタウイルス株の分子特性および進化学的解析（Analyses of molecular characteristics and evolution of novel NSP4 mono-reassortant G1P[8]-E2 rotavirus strain） (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤井克樹、津川毅、村松正道
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] Changes in the distribution of genotype constellations of rotavirus strains after rotavirus vaccine introduction in Asian and African countries (2022)
  • 著者名/発表者名: Yen Hai Doan, Nobuhiro Takemae, Toshihiko Suzuki Francis Ekow Dennis3, George Enyimah Armah, Takako Utsumi, Ikuo Shoji, Laura Navika Yamani, Okayama University, Manta Chawla-Sarkar, Tomoichiro Oka, Yoshiki Fujii, Hiroyuki Shimizu, Masamichi Muramatsu, Tsutomu Kageyama, Kazuhiko Katayama
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] ロタウイルスの培養細胞における増殖系の効率化とウイルス分離 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤井克樹
  • 学会等名: ウイルス性下痢症研究会第33回学術集会