研究課題/領域番号 |
22K07105
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分49060:ウイルス学関連
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研究機関 | 自治医科大学 |
研究代表者 |
長嶋 茂雄 自治医科大学, 医学部, 講師 (60433116)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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キーワード | E型肝炎ウイルス / レポーターウイルス / 生物発光タンパク質 / HiBiTタグ / ウイルス放出 / 薬剤スクリーニング / レポーターアッセイ / 化合物 / スクリーニング / 増殖抑制 |
研究開始時の研究の概要 |
E型肝炎ウイルス (HEV) 感染は、世界的に急性肝炎の主要な原因となっている。しかしながら、現在までE型肝炎に対する特異的な治療法は確立されておらず、有効な抗HEV薬の登場が望まれている。 本研究では、これまでに得られたHEV受容体に関する研究成果を踏まえ、レポーター遺伝子を搭載した感染性HEVを用いた新規スクリーニング系により、ウイルスと受容体の結合を阻害する化合物を同定する。また、粒子形成ならびに放出を阻害する化合物を同定し、感染培養系を用いて、これらの化合物の増殖抑制効果を実証する。
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研究実績の概要 |
本研究は、E型肝炎ウイルス (HEV) の感染初期過程と後期過程を阻害する化合物を同定することである。これまでに、HEVのORF1蛋白質(非構造蛋白質)にnanoKAZ遺伝子を搭載した感染性を有するリコンビナントHEVの開発に成功しており、これによりHEVの感染初期過程(吸着および侵入)を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となった。 本年度は、感染後期過程を阻害する薬剤を同定するための新規スクリーニング系を開発するために、HEVのORF2蛋白質(構造蛋白質)にHiBiTタグを搭載した感染性のリコンビナントウイルスを作製した。ORF2蛋白質にHiBiT配列を挿入した組換えHEV RNAを導入したPLC/PRF/5細胞では、培養上清中に膜に覆われたHEV粒子 (eHEV) が産生され、挿入したHiBiT配列も維持されていた。また、培養上清中のeHEV-HiBiTを新たな細胞に接種したところ、感染性が認められた。ORF2蛋白質に融合したHiBiTは、脂質膜の内側に発現しているが、eHEV-HiBiT粒子を界面活性剤で処理することにより検出が可能であった。そこで、薬剤スクリーニングに応用するために、siRNAを用いて細胞内のTsg101、Rab27A、Hrsをノックダウンした細胞にHEV-HiBiT RNAを導入し、4日後に培養上清中の膜に覆われたHEVをHiBiTシステムにより検出した結果、放出効率の低下が認められた。 膜に覆われたHEVは、宿主細胞のエクソソーム分泌経路を利用して細胞外へと放出される。そこで、HEVの放出を阻害する薬剤を同定するために、エクソソーム化合物ライブラリを用いて薬剤スクリーニングを実施した。その結果、HEVの放出を阻害することにより抗HEV活性を示す複数の薬剤を同定することができた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、E型肝炎ウイルス (HEV) のキャプシド蛋白質にHiBiTタグを保有する感染性の組換えHEV (HEV-HiBiT) の開発に成功した。また、新規スクリーニング系を利用することにより、HEVの放出を阻害する複数の薬剤を同定することができた。これらの薬剤については、感染培養系を用いた増殖抑制効果の検討が進行中である。 低分子化合物ライブラリを用いたHEVの細胞内侵入を阻害する化合物の探索についても、すでにHEV-nanoKAZを利用したスクリーニングが終了しており、抗HEV活性を有する複数の化合物を同定した。これらの薬剤についても、感染培養系を用いた阻害効果や阻害機序についての解析が進められており、研究は当初の計画通り進捗している。
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今後の研究の推進方策 |
今後は、感染受容体を標的とする化合物の同定を行う予定である。すでに、レポーター遺伝子 (nanoKAZ) を搭載した感染性を有する膜に覆われたHEV粒子 (eHEV-nanoKAZ) と膜に覆われていないHEV粒子 (neHEV-nanoKAZ) は作出できており、スクリーニングに利用することが可能である。同定された化合物については、感染培養系を用いて、増殖抑制効果を解析する予定である。 また、HEVの粒子形成を阻害する低分子化合物を同定するためのnanoBiTシステムについても予備検討を進めており、今後、スクリーニングを実施する予定である。
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