| 研究課題/領域番号 |
22K07140
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49070:免疫学関連
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
森田 林平 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00362541)
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| 研究分担者 |
佐々木 文之 日本医科大学, 医学部, 助教 (10706469)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | エンドサイトーシス / インフラマソーム / 炎症 / 自然免疫 / マクロファージ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
マクロファージはファゴサイトーシスやエンドサイトーシスにより細胞外物質を積極的に取り込み、炎症性サイトカインに産生により炎症を誘発する。これまで炎症性サイトカインの産生を制御する様々な分子機構が見出されてきた。
一方、本研究ではクラスリン重鎖に焦点を当て、「エンドサイトーシス自体がNLRP3インフラマソームの形成を制御する」という新しい炎症制御機構の解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
エンドサイトーシスは、クラスリン重鎖と軽鎖から成るクラスリン被覆小胞により病原体や外部物質を細胞内に取り込む機構であり、取り込まれた病原体や物質はNLRP3インフラマソームの形成を誘導しIL-1b/ IL-18の産生を引き起こす。この様にエンドサイトーシスはインフラマソーム形成誘導因子の取り込みに重要である。既に申請者はクラスリン重鎖（CHC）がNLRP3の結合因子であることを見出している。そこで本研究では「エンドサイトーシスはCHCを介してNLRP3インフラマソーム形成を制御する」という仮説の元に研究を進めてきた。
先ず、NLRP3とCHCの様々な部位欠損変異体の発現ベクターを作成し、293T細胞に発現させ、免疫沈降法によりNLRP3とCHCの結合部位を決定した。その結果、NLRP3のLRRドメインとNACHTドメインの前半部位が共にCHCの結合に重要であり、一方、CHCでは繰り返し構造部位（R1～R6）がNLRP3との結合に重要であることが明らかとなった。
興味深いことに、NLRP3のNACHTドメインの前半部位はATP結合部位、CHC繰り返し構造部位（R5～R6）はクラスリン軽鎖（CLC）結合部位であることから、NLRP3はCLCと競合してCHCに結合し、CHCはNLRP3のATP結合を制御することが予想された。実際に私達はin vitroにてCLCはNLRP3とCHCの結合効率を阻害することを明らかにした。更にCHCはNLRP3に結合することでNLRP3のATPase活性を促進することを見出した。
これらの所見は、エンドサイトーシスはNLRO3インフラマソームの形成を遠隔コントロールすることを示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NLRP3とCHCの結合部位を明らかにするとともに、その結合部位の機能から「エンドサイトーシスはNLRO3インフラマソームの形成を遠隔コントロールする」という当初の仮説に迫ることができた。
加えて、タモキシフェン誘導型マクロファージ特異的Cltc欠損マウス（Cltcf/f; LysM-CreERT2マウス）の交配と繁殖が順調に行われている。
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| 今後の研究の推進方策 |
タモキシフェン誘導型マクロファージ特異的Cltc欠損マウスを用いて、炎症モデル実験（LPS敗血症モデル、葉酸誘導急性腎障害モデル、痛風モデル）を行い、「エンドサイトーシスはNLRO3インフラマソームの形成を遠隔コントロールする」生理的意義を個体レベルで明らかにする。
一方、Cltc欠損マクロファージを骨髄細胞から作成し、主にイメージングによりエンドサイトーシス刺激によりNLRP3とCHCの細胞内局在の変化を明らかにする。
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