| 研究課題/領域番号 |
22K07201
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分50010:腫瘍生物学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
三城 恵美 (佐藤恵美) 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任講師 (00455544)
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| 研究分担者 |
藤下 晃章 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (50511870)
梶野 リエ 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (20633184)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 翻訳後修飾 / 大腸がん / プロテオミクス / RNA修飾 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析した。その中からアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、さらにNAT10の阻害は大腸がん細胞の増殖を強く抑制することを見出していた。
本研究では、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的としている。本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることが期待される。
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| 研究実績の概要 |
大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析し、その中から翻訳後修飾のひとつであるアセチル化修飾に着目した。さらにアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的とし、本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることを期待している。
A）NAT10のRNAアセチラーゼ活性が大腸がん細胞の生存・増殖に果たす役割の検討
研究分担者の多大なる協力の下、家族性大腸腺腫症から作製されたオルガノイドでもドキシサイクリン誘導性NAT10の発現抑制系の作製に取り組んでいる。
B) NAT10のリジンアセチル化の機能解析
・アセチル化部位の変異体を作製した。研究分担者の多大なる協力の下、アセチル化サイトのリジン残基(K: 正電荷) をアセチル化ミミックとしてグルタミン残基(Q: 中性)へ、コントロールとして同じ正電 荷でアセチル化されないアルギニン残基(R: 正電荷)に置換した変異体を作製した。
・NAT10のリジンアセチル化部位特異的抗体の作製を実施した。NAT10のリジンアセチル化部位を検出できるよう、NAT10のアセチル化修飾付近の配列において非アセチル化ペプチドは認識せず、アセチル化ペプチド特異的に認識する抗体を作製し、ELISA法ではしっかり区別できる抗体を作製することができた。しかし、ウエスタンブロッティングや免疫沈降法に対して本リジンアセチル化部位特異的抗体を用いると特異的な反応が見られず、NAT10自体にも反応しない抗体であることが分かってしまった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現職での業務が多く、十分な解析時間が取れていない状況ではあるものの、プロテオミクスの解析技術は安定してきた。
研究分担者の多大なる協力の下、NAT10のアセチル化部位の変異体を各種作製することができ、さらにNAT10のリジンアセチル化部位特異的抗体の作製を実施した。ELISA法ではしっかり区別できる抗体を作製することができたものの、ウエスタンブロッティングや免疫沈降に対しては、様々な検証も虚しく残念ながらリジンアセチル化にもNAT10にも反応がない抗体となってしまった。検証の際には作製したNAT10リジンアセチル化部位変異体とWTを用いて比較したり、NAT10ノックアウト細胞を用いたりGFPタグ付きNAT10-WTをレスキューした場合も変動がなかった。抗体作製は狙い通りにいかないこともあるため、他のアプローチに変更する。NAT10のアセチル化部位の変異体はきちんとできているので別の方法で検証する。
昨年度構築できた大腸がん細胞株だけでなく、家族性大腸腺腫症由来のオルガノイドについてもドキシサイクリン誘導性NAT10発現抑制系の構築に着手している状態である。
以上のことから、おおむね順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
プロテオミクスに関しては、質量分析装置を用いた前処理や測定・解析の方法はかなり習熟させることができてきた。
抗体作成は難しかったが、大腸がん細胞におけるドキシサイクリン誘導性NAT10発現抑制系の作製を発展させた家族性大腸腺腫症患者由来のオルガノイドに対しても準備が進んでいる。また、作製した様々な変異体も作製できていることから、これらの細胞系を用いたプロテオミクスによる機能解明を進める予定にしている。リン酸化やアセチル化、メチル化などの翻訳後修飾変化を検出できる環境が整っているため、解析を進める予定にしている。
解析技術についてノウハウを持っている方とのネットワークも広げられたので、ますます知識を深めているところであり、得られたデータを解釈する技術が上がっていると思っている。
愛知県がんセンターとの物理的な距離はどうしてもあるが、訪問するだけでなくこちらに訪問していただく機会を増やしたり、より連携を深めていきたいと考えている。
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