| 研究課題/領域番号 |
22K07288
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分50020:腫瘍診断および治療学関連
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| 研究機関 | 横浜薬科大学 |
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研究代表者 |
岩瀬 由未子 横浜薬科大学, 薬学部, 准教授 (00521882)
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| 研究分担者 |
矢野 健太郎 横浜薬科大学, 薬学部, 講師 (40644290)
桑原 隆 横浜薬科大学, 薬学部, 教授 (90786576)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | ニューキノロン系抗菌薬 / 細胞増殖抑制 / 光化学作用 / DDS / 超音波 / 薬物送達 / 抗腫瘍効果 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
アポトーシス能の低下は癌細胞の異常増殖に関与する。また、癌治療における薬物療法において投与された抗癌剤が癌細胞に十分量到達できないことに加え、健常細胞に対しても作用を発現することは治療の大きな障壁となっている。一重項酸素は細胞内で産生されるとアポトーシスを誘発することから、薬物を細胞内に送達し、一重項酸素を産生させることは局所的な殺細胞効果発現が可能となると考えられる。ニューキノロン系抗菌薬（NQLs）はそれ自身ではほとんど細胞毒性を有しないが、UVAにより活性化され、一重項酸素を産生することができる。そこで、NQLsを抗癌剤として転用可能かを検証する。
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| 研究実績の概要 |
癌細胞の異常増殖の一因にアポトーシス能の低下が考えられることから、癌細胞に対し、アポトーシスを誘発させることは、予後の良い治療効果が期待できると考えられる。一重項酸素は細胞内で産生されることにより、細胞に損傷を与える。そこで、本年は、UVAと併用処置することにより一重項酸素を産生するニューキノロン系抗菌薬を使用し、細胞増殖の抑制効果および抑制効果発現因子の解明を目的として検討を行った。
まず、細胞増殖抑制効果の検証を行った。本検討は、未処置、薬物単独処置、UVA単独処置、薬物とUVA併用処置で比較した。UVAは365 nmを中心とする波長を用い、反応開始後48時間まで細胞数を計測することで細胞増殖率を算出した。さらに、音響化学的にニューキノロン系抗菌薬を細胞内に送達することで細胞増殖抑制効果が促進されるかについての検討を行った。加えて、細胞増殖抑制にアポトーシス誘発が関与するかについて調査した。アポトーシスの評価は、位相差顕微鏡を用いた形態観察において、blebbingや小胞化が生じるか観察した。次に、細胞膜表面に露出してくるフォスファチジルセリンへの蛍光標識annexin Vの特異的結合を指標とした。同時に膜透過性のない核染色色素である7-amino-actinomycin Dを添加し、アポトーシス以外の細胞死についても確認した。さらに、アポトーシス誘発時にはDNAの断片化が起きるので、DNAの断片化についてアガロース電気泳動法を用いて評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
HUT78細胞にニューキノロン系抗菌薬を添加し、UVA併用処置した場合の細胞増殖抑制効果は、未処置、薬物単独処置およびUVA単独処置においてはほとんど認められなかった。一方で、薬物とUVA併用処置においては未処置の場合に比べ五分の一倍となり、顕著な細胞増殖抑制効果が認められた。ニューキノロン系抗菌薬によりUVA照射により産生される一重項酸素量は異なる。しかしながら、細胞増殖抑制効果は同程度であり、一重項酸素の産生量の違いが細胞増殖抑制に大きく影響しているとはいいがたかった。また、音響化学的にHUT78細胞内にニューキノロン系抗菌薬を送達後、UVA照射処置を行った場合の細胞増殖抑制効果は音響化学的に薬物送達処置を施さなかった場合と比較し、差は認められなかった。
ニューキノロン系抗菌薬とUVA併用処置により細胞増殖抑制効果が確認できたので、細胞増殖抑制に関与した要因を調べた。この結果、アポトーシス特有のblebbingや小胞化といった細胞の形態学的変化を位相差顕微鏡にて確認することができた。アポトーシスが誘発されていることを蛍光標識annexin Vおよび7-amino-actinomycin D添加により評価した。この結果、実験開始後48 h経過後のサンプルにおいて蛍光標識annexin VのHUT78への結合は薬物とUVA併用処置において強く検出された。しかしながら、未処置細胞においても検出された。また、DNAの断片化についてアガロース電気泳動法を用いて調べたところバンドが薄く、DNAの断片化が生じているとは断言できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ニューキノロン系抗菌薬とUVA併用処置による細胞増殖抑制効果発現に関与する因子のため、アガロース電気泳動法によるDNAの断片化およびcaspase-3の活性化を調査する。caspase-3の活性化についてはAc-DEVD -AFCを添加し、遊離されるAFCの蛍光強度を指標とする。並行して、ニューキノロン系抗菌薬とUVA併用処置による細胞増殖抑制効果が固形癌の治療効果につながるかをin vivoで検討する。マウス皮下または、SCIDマウス皮下に皮膚癌由来の細胞株を移植し、腫瘍を形成後、マウスにNQLsを経口投与し薬物が全身循環に到達したのち、腫瘍部分にUVAを照射する。治療効果の判定は、腫瘍経を測定し腫瘍経の縮退を判定する。また、TUNEL 染色を行い固形腫瘍におけるアポトーシス誘導を確認する。
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