| 研究課題/領域番号 |
22K07356
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分51030:病態神経科学関連
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
大友 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (50535226)
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| 研究分担者 |
秦野 伸二 東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / ALS / 上位運動ニューロン / 下位運動ニューロン / 骨格筋 / iPS細胞 / 細胞モデル |
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| 研究開始時の研究の概要 |
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）は、大脳皮質運動野の上位運動ニューロン（UMNs）と脳神経及び脊髄前角の下位運動ニューロン（LMNs）の選択的変性と脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。本研究では、これまでほとんど研究対象とされていない UMNsと LMNs の形成するシナプス機能や、LMNsと MSCs の結合によって形成される神経筋結合部の機能に着目し、健常者とALS細胞モデルを比較、解析することによって、ALS疾患における UMNs 及び LMNs の細胞種特異的な疾患感受性を生みだす分子メカニズムを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）は、大脳皮質運動野の上位運動ニューロン（UMNs）と脳神経及び脊髄前角の下位運動ニューロン（LMNs）の選択的変性と脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。本研究では、ALS疾患特異的障害部位である、UMNsとLMNs、及びLMNsと骨格筋（MSCs）の機能的な結合、さらにはUMNsとLMNs及び MSCs の結合を有する新たなALS細胞モデルを構築することを目的とする。本年度は、新たな細胞材料の開発とその細胞表現型の評価を進めた。ALS疾患モデル細胞として、上位運動ニューロン優位型のALS2型（ALS2変異）と、下位運動ニューロン優位型ALS6型（FUS変異）に着目した。健常者由来の人工多能性幹細胞（iPSCs）、そのALS2ノックアウトiPSCs、及びその同一遺伝子背景にFUS変異を持つiPSCsをモデルの作製に用いた。それらiPSCsを用いて、LMNsの運命決定遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現する遺伝子カセットを導入し、安定的にそれらを発現する細胞をプールとして確保した。健常者、ALS2型、FUS型のiPSCsを下位運動ニューロンへと分化誘導後、細胞生存率について解析を行った結果、分化誘導後2-3週間の時点においてもFUS細胞モデルにおいて顕著に細胞生存率が低下していた。ALS2細胞モデルを作製するために、UMNsモデル細胞の誘導をLMNsと同一の手法を用いて試みた。UMNsモデル細胞を誘導後、細胞の性質を明らかにするためにmRNA-sequencing 解析を行った結果、グルタミン酸作動性神経細胞を主とする細胞集団であることを確認した。また、MSCsについてもiPSCsに特定の遺伝子を発現させ、myoblast細胞を誘導後、一定条件下でmyotube誘導方法を確立した。現在、UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めている。本年度は、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めているが、両者のシナプス形成に有する期間が、想定していたより長く（現段階では40日以上が必要であることが判明しつつある）、実験の条件設定などに、時間を必要としている。現在、培養期間以外の培養条件の設定を継続して行っている。また、研究立案の段階では、スフェロイド様の細胞同士を用いた共培養系の確立と解析を主眼としていたが、解析の際に定量化が難しいこと、再現性が得にくいことなどの問題が生じている。そのため、マイクロデバイスを用いた平面における共培養などの様々な培養方法及び評価方法についても実験計画に導入し、その評価について検討する計画である。これらの手法を用いて、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。
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| 今後の研究の推進方策 |
UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めているが、両者のシナプス形成に有する期間が、想定していたより長いことが判明した。２種の神経細胞のみでは、シナプス形成効率が低いことが示唆される。そのため、シナプス形成を補助するグリア細胞などの共培養や、細胞外のマトリックスなどの細胞培養環境についても検討する必要がある。特に、アストロサイトとの共培養は、シナプス安定性などに一定の効果が期待できるため、アストロサイトとの共培養を試みる。また、研究立案の段階では、スフェロイド様の細胞同士を用いた共培養系の確立と解析を主眼としていたが、解析の際に定量化が難しいこと、再現性が得にくいことなどの問題が生じている。そのため、マイクロデバイスを用いた平面における共培養などの様々な培養方法及び評価方法についても実験計画に導入し、その評価について検討する計画である。これらの手法を用いて、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。
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