ポリアミンが誘導するリピート病の発症機構とその制御による病態抑制効果の解明

研究課題

研究課題/領域番号	22K07357
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分51030:病態神経科学関連
研究機関	東京慈恵会医科大学
研究代表者	小黒明広東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00292508)
研究分担者	今高寛晃兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942) 植村武史城西大学, 薬学部, 准教授 (50401005)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス	交付 (2023年度)
配分額 *注記	4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円) 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
キーワード	RAN翻訳 / ポリアミン / リピート病 / 無細胞翻訳系 / 筋強直性ジストロフィー
研究開始時の研究の概要	リピート病は、遺伝子内の異常伸長した繰り返し配列に起因する疾患群である。特定のリピート配列では翻訳開始コドンを必要としない特殊な翻訳（RAN翻訳）が誘導され、これが発症の原因となる。これまでにRAN翻訳誘導の分子機構は明らかになっていない。本研究は、我々の先行研究でRAN翻訳を誘導することが判明したポリアミンに着目し、無細胞翻訳系、培養細胞系、モデル生物系と段階的に解析を進め、RAN翻訳誘導におけるポリアミンの作用機序およびポリアミンとその関連因子の制御による病態抑制効果を解明する。本研究より、ポリアミンと関連因子を標的としたリピート病の新規治療法の開発につなげていく。
研究実績の概要	リピート病は、遺伝子に存在する繰り返し配列の異常伸長を特徴とする難治性の疾患群である。特定のリピート配列においてリピート関連非ATG翻訳(RAN翻訳)と呼ばれる特殊な翻訳が誘導され、リピート病発症の原因となるが、その分子機構は未解明である。本研究は、我々の先行研究でRAN翻訳を誘導することが判明した生理活性物質ポリアミンに着目し、i)無細胞翻訳系、ii)培養細胞系、iii)モデル生物系と段階的に解析を進め、RAN翻訳誘導におけるポリアミンの作用機序を解明する。さらに、ポリアミンとその関連因子の制御による病態抑制効果を明らかにすることを目的とする。 2023年度は３段階ある研究計画のうち、i)無細胞翻訳系とii)培養細胞系での解析を進めた。無細胞翻訳系で筋強直性ジストロフィー２型（DM2）の原因となるCCUGリピート由来のRAN翻訳を再現し、ヒト主要ポリアミンのプトレッシン、スペルミジン、スペルミンの3種類によるRAN翻訳促進効果を詳細に解析した。その結果、いずれのポリアミンでも促進効果がみれれたが、特にスペルミンによる効果が高かった。また、HEK293を用いた培養細胞での実験で、ポリアミン合成阻害剤を培地へ添加して細胞内のポリアミン濃度を低下させると、RAN翻訳は抑制された。この抑制条件下でポリアミンを加えるとRAN翻訳は回復した。抑制および回復効果は細胞内スペルミン量と相関関係にあった。このポリアミンによるRAN翻訳促進の効果を分子レベルで解明する目的で、CCUGリピートRNAの熱融解温度の測定を行い、スペルミジンとスペルミンの効果を調べた。その結果、両者で安定化の効果が見られたが、スペルミンの方がより強い効果を有することが分かった。このことより、リピートRNAの安定化とRAN翻訳誘導の関連性が強く示唆され、ポリアミンによるRAN翻訳誘導の分子機構の一端が明らかになった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 2023年度までに、i)無細胞翻訳系、およびii)培養細胞系でのRAN翻訳に対するポリアミンの影響について、計画していた解析をほぼ完了でき、順調に進展していると判断する。ポリアミンの作用効果として、eIF5Aのハイプシン化促進への関与を無細胞翻訳系での実験により否定し、生化学的な解析よりリピートRNAの構造安定化にポリアミンが寄与し、RAN翻訳を促進するという分子機構を明らかにした。この効果はスペルミンが最も強いことも明らかにした。さらに、培養細胞の実験より、細胞内のスペルミン量を低下させることでRAN翻訳を抑制できることを明らかにした。これらの成果は、ポリアミン、特にスペルミンがリピート病の治療標的となり、細胞内のスペルミン量を低下させるこが治療に有効であることを示す。また、ポリアミンの作用標的がリピートRNAであることを明らかにしたことで、ポリアミンとリピートRNAとの相互作用を阻害する方法も治療に有効であることを示す。このように、RAN翻訳の分子機構を解明でき、治療のための分子標的、アプローチ方法を提示できたことは、当該研究を次の段階へと進展させるに足る十分な成果を得たと判断できる。以上のことから、研究計画は当初の予定通りに進んでおり、目標を達成できたと評価する。今後は、iii)モデル動物を用いた解析として、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエをモデル生物の候補に考え、ポリアミンとRAN翻訳の関係性、ポリアミン抑制によるRAN翻訳の抑制効果を解析する計画である。
今後の研究の推進方策	2023年度までに、①無細胞翻訳系、培養細胞系でRAN翻訳をポリアミンが促進すること、②培養細胞系で細胞内のポリアミン量を低下させることでRAN翻訳を抑制できること、③ポリアミンがリピートRNAの構造の安定化を行う効果があることを明らかにしてきた。さらに、スペルミンが最も高い効果を示すことも明らかにした。これらの研究成果は、１）スペルミンがリピート病の病態抑制の分子標的となり得ること、２）リピートRNAの高次構造の緩和が病態抑制に有効であること、を示唆する。これらを基に、2024年度はモデル生物を用いて、ポリアミンと病態発症の関連性、およびスペルミン濃度低下による病態抑制効果を調べていく。当初の計画ではモデル生物としてショウジョウバエを想定しているが、ゼブラフィシュでの疾患モデルの作成も計画している。まずはゼブラフィッシュの生体内でRAN翻訳を再現させ、ポリアミン量と疾病との関連性を解析していく。さらに疾患モデル生物を使って、in vitroでの解析で有効性が証明された化合物を使ってRAN翻訳の抑制効果を調べていく。また、ここまではDM2の原因となるCCUGリピートの解析が先行し、研究成果を順調に得ているが、DM1の原因となるCUGリピートの解析も進めている。DM1とDM２では病態は似ているが、DM1にはCUGリピート配列により発症するモデルマウスが存在するため、このモデルマウスを使った解析も計画する。