| 研究課題/領域番号 |
22K07391
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52010:内科学一般関連
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
森下 英理子 金沢大学, 保健学系, 教授 (50251921)
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| 研究分担者 |
小原 收 公益財団法人かずさDNA研究所, その他部局等, 副所長 (20370926)
荒磯 裕平 金沢大学, 保健学系, 助教 (20753726)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 遺伝性血栓症 / アンチトロンビン（AT）欠乏症 / プロテインC(PC)欠乏症 / プロテインS（PS）欠乏症 / パネル検査 / ノックアウトゼブラフィッシュ / 静脈血栓塞栓症 / VTE |
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| 研究開始時の研究の概要 |
遺伝性血栓症の病因解明のため、血栓性素因関連遺伝子群の次世代シークエンス(NGS)パネルを用いた遺伝子バリアントの同定、RNAを用いたトランスクリプトーム解析や網羅的なプロテオーム解析を組み合わせた統合的（オミックス）検査方法を確立し、病態を解明する。さらに、患者の臨床所見とゲノム情報を照合し、本邦独自の「各遺伝子バリアントのリスク度」を求め、層別化された血栓リスクに適した予防・治療の早期提供を目指し、遺伝性血栓症患者の病因・病態解明、ゲノム情報からの血栓リスクの層別化を図り、個別化医療へと繋がる包括的なアプローチを行う。
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| 研究実績の概要 |
①静脈血栓塞栓症（VTE）のリスク因子の一つである遺伝性血栓症においては、遺伝子バリアントの同定率はアンチトロンビン（AT）欠乏症約9割、プロテインC(PC)欠乏症5割、プロテインS（PS）欠乏症にいたっては3～4割程度である。このように、バリアントの同定率は標的遺伝子で異なり、原因不明も100例近くあり、現行法のDNA解析では確定診断に限界がある。そこで、遺伝性血栓症の病因解明のために、血栓性素因関連遺伝子群のNGSパネルを用いた遺伝子バリアントの同定、さらには標的遺伝子のRNAを用いたトランスクリプトーム解析や網羅的なプロテオーム解析を組み合わせたオミックス解析による検査法を確立することを目的とした。
②当研究室では、全国から遺伝性血栓性素因の遺伝子解析の依頼があり、新規バリアントが発見された場合は、そのバリアントの遺伝子組換え蛋白を作成し、機能低下をきたす機序について解析を行なっている。特に、活性化PC抵抗性（APCR）を示す第V因子(FV)異常症であるFV Y1964Cのリン脂質結合障害を解析するために、Liposome flotation assayの実験系を構築する。凝固反応は全てリン脂質二重膜上で起こるが、これまでに脂質二重膜を形成して凝固因子との結合実験を行った報告は皆無である。ネイティブに限りなく近い脂質二重膜と凝固因子の結合を直接検出するアッセイ系を構築されると、これまで解明されてこなかった凝固因子と生体膜の結合メカニズムの理解が大幅に進むことが期待される。
③AT欠乏症ホモ接合体は胎内致死をきたすため、マウスなどの哺乳類モデルによって解析することは困難である。そこで、初期胚が透明で生きたまま簡便に組織観察を行うことができるゼブラフィッシュを用いることで胎内致死変異の病態を解析するための新規ツールを開発する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①血栓性素因関連遺伝子群のNGSパネル作成のための標的遺伝子を文献などを参考にして54個選定した。現在、かずさDNA研究所にてハイブリキャプチャー法により全対象遺伝子の蛋白質コードエクソンとそのイントロン境界部の塩基配列を登録衛生検査所グレードの精度管理の下に決定するパネルを作成中である。
②遺伝子バリアントの病態解明については、この1年間でアンチトロンビン（AT）欠乏症3例、プロテインC(PC)欠乏症2例の新規バリアントを同定した。これらの新規バリアントについて遺伝子組換え蛋白を作成し、機能低下をきたす機序についての解析を行った。一方、APCRを示すFV異常症FV Y1964Cのリン脂質結合障害を解析するために、Liposome flotation assayの実験系を構築した。さらに他の脂質結合タンパク質を用いた予備検討を行うことで、脂質結合評価系が機能することを確認した。遺伝子組換えFVの精製が出来次第、本評価系を適用しFVやその変異バリアントのリン脂質膜結合能を解析することが可能である。一方、ＦＶの立体構造情報に基づき、リン脂質膜結合部位や変異バリアントが結合能に与える影響をin silicoにて予測した。
③ATノックアウト体ゼブラフィッシュをCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術によって作成することに成功した。予想に反してノックアウト体は胎内致死することなく生まれてはきたが、wild typeと比較すると生存期間は短縮していた。形態の観察では、動脈の血流は保たれているが静脈の血流が停留している所見が観察された。
④AT欠乏症について、human Gene Mutation Data Baseなどを用いて遺伝子バリアント部位と臨床情報をAIに入力し、新たな遺伝子バリアントについて血栓症の重症度など予測するモデルを作成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
①血栓性素因関連遺伝子のパネル検査が完成したら、これまでに既知遺伝子に病的バリアントを同定できなかった後ろ向き検体約50例について解析を行う。NGS解析での複数の診断例・未診断例について、血漿・白血球についてData-independent acquisition (DIA)法による網羅的な質量分析ベースの定量プロテオーム解析によりペプチドレベルでの量的変動を解析し、さらに並行して白血球細胞分画についてNGS検査対象遺伝子のターゲットトランスクリプトーム解析を実施して、mRNA量の変化、mRNAレベルでの配列変異の検出、スプライシングパターン変化などの有無とタンパク質プロファイルのデータを統合する。
②遺伝子組換えFVの精製が出来次第、確立したLiposome flotation assayを用いて、wild type FVならびにFV Y1964Cバリアントのリン脂質膜結合能を解析し、比較する。
③ATノックアウト体ゼブラフィッシュの作成に成功したので、血栓形成のライブイメージングや、赤血球や血小板に蛍光標識し、さらに詳細に血栓形成メカニズムを観察する。さらに、PSノックアウト体ゼブラフィッシュの作成にも取り組む。
④さらにPC欠乏症についても、AIに遺伝子バリアントの部位と臨床情報を入力し、新たな遺伝子バリアントについて血栓症の重症度など予測するモデルを作成する。
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