エクソソームの輸送先選択性に基づきタウの伝播阻止を目指すアルツハイマー病治療

研究課題

研究課題/領域番号	22K07503
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分52020:神経内科学関連
研究機関	帝京大学
研究代表者	磯尾紀子帝京大学, 医学部, 講師 (90548330)
研究分担者	林俊宏帝京大学, 医学部, 教授 (60505890) 磯尾直之帝京大学, 医学部, 准教授 (80420214)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス	交付 (2023年度)
配分額 *注記	4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円) 2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円) 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
キーワード	アルツハイマー病 / エクソソーム / タウ / 輸送機構 / 脳内伝播
研究開始時の研究の概要	アルツハイマー病における病原性タンパク質タウの脳内伝播を担うエクソソームには輸送先を規定する特性が備わっており、輸送先を規定する因子が存在するという仮説を検証するため、細胞内タウ凝集体の形成誘導が可能な細胞株をアルツハイマー病の疾患モデル細胞として新しく樹立し、その細胞から放出されるエクソソームの特性を疾患モデルマウスを用いて解析することによってタウの脳内伝播を担うエクソソームを同定した上で、タウの輸送先を規定する因子を探索・同定する。さらに輸送先規定因子を標的とした治療法を開発する。
研究実績の概要	当該年度は、昨年度に見出したNeuro-2a細胞から精製・回収したタウ内包エクソソームが密度勾配遠心法を用いた生化学的解析の結果、エクソソームマーカータンパク質であるCD9/63/81を有する古典的なエクソソームとは異なるという知見について、FACSを用いたシングルエクソソーム解析を実施し、検証した。タウ内包エクソソームは、直径100-200 nmの小さい群と直径250-500 nmの大きい群に分かれて検出され、小さい群は、おおよそエクソソームと同じサイズであると考えられた。この小さいエクソソーム群において、CD9/63/81の発現量が、Neuro-2a細胞由来のタウを含まないエクソソームと比較し、タウ内包エクソソームで有意に減少しているという結果であった。今回の結果は、近年指摘されている構成タンパク質の相違などによるエクソソームの多様性が存在することを示唆するものと考えられた。また、昨年度からこのタウ内包エクソソームの膜を蛍光標識して野生型マウスの海馬に注入した上で、その脳内分布を観察し、神経細胞への取り込みや輸送先などを解析している。海馬CA1野へ注入7日後に灌流固定を行い、作製した脳切片についてタウと成熟神経細胞マーカーであるNeuNに対する抗体を用いて免疫組織染色を実施し、蛍光顕微鏡下で観察した。エクソソームおよび内包タウは注入部位であるCA1野の錐体細胞内のみならずその直接の投射先である海馬台の錐体細胞内でも観察されたが、CA1野の錐体細胞へと投射するCA3野の錐体細胞内ではほとんど観察されなかった。したがって、大部分のタウ内包エクソソームはマウス脳内で海馬CA1野の錐体細胞内に取り込まれた後、その投射先である海馬台へと軸索内を順行性に輸送され、海馬CA3野の錐体細胞へと逆行性に輸送されることはなかったと考えられた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由タウ内包エクソソームについての生化学的解析の結果、タウはCD9/63/81を有する古典的なエクソソームとは異なるエクソソームに内包されるという新たな特性を見出すことができた。現在はin vitroおよびin vivoの両面からエクソソームの細胞間輸送機構についての研究が進展している。
今後の研究の推進方策	これまでに確立した蛍光標識タウ内包エクソソームを神経細胞の培養上清中へ添加し、細胞へのuptakeをライブセルタイムラプスイメージングにより解析するuptake assayを用いてエクソソームの細胞へのuptakeに関与する分子機構を解明する。種々のエンドサイトーシス阻害剤のuptakeに与える影響を解析するとともに、LC/MS-MSによるタウ内包エクソソームのプロテオミクス解析を実施する。また、アルツハイマー病のモデル動物であるAPP-KIマウスを入手し、タウ内包エクソソームを注入して病態の進展に与える影響を解析する予定である。