| 研究課題/領域番号 |
22K07622
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52030:精神神経科学関連
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
泉 剛 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (60312360)
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| 研究分担者 |
鹿内 浩樹 北海道医療大学, 薬学部, 講師 (00632556)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | うつ病 / 動物モデル / 海馬 / テロメア / テロメラーゼ / β-catenin / 幼若期ストレス / テロメア―ゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
テロメアは細胞寿命の決定因子である。うつ病モデル動物（幼若期ストレス、3WFS）でテロメアを検討したところ、海馬でテロメアが短縮し、テロメア複製酵素であるTERTが減少しており、GSK3βの活性が増加していた。GSK3βはβ-cateninを阻害し、β-cateninはTERTの転写を促進するため、GSK3βの活性増加によりテロメアが短縮した可能性が考えられた。本研究では、3WFSラットの海馬で、β-catenin活性低下を実証すると共に海馬でβ-cateninのコンディショナルノックアウトを行い、テロメアが短縮するかどうか確認する。これより、うつ病におけるテロメア短縮のメカニズムを追及する。
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| 研究実績の概要 |
テロメアは細胞寿命の決定因子であり、うつ病とテロメア短縮の関連が報告されている。うつ病モデル動物（幼若期ストレス、3WFS）でテロメアを検討したところ、海馬でテロメアが短縮し、テロメア複製酵素の活性ユニットであるTERTが減少しており、うつ病関連分子であるGSK3βの活性が増加していた。β-cateninは核内へ移行してTERTの転写を促進するが、GSK3βはβ-cateninを阻害するため、GSK3βの活性増加によりテロメアが短縮した可能性が考えられた。この仮説を実証するために3WFSの海馬において核分画のβ-catenin量を定量する必要がある。
Thermo Fisher Scientific社のキットを使用して、ラットの脳サンプルで細胞分画が可能かどうか検討した。海馬を分離し、核及び細胞質分画に分けた。核分画のマーカーとしてHDAC2、細胞質分画のマーカーとしてGAPDHを用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、核分画ではHDAC2のバンドが認められ、GAPDHのバンドは認められなかった。逆に、細胞質分画ではHDAC2のバンドは認められずに、GAPDHのバンドが認められた。これより、細胞分画は成功したと思われた。
一方、うつ病モデル動物の海馬におけるTERT減少の意義を確認するため、海馬におけるTERTのコンディショナル・ノックアウトを試みた。Jackson Laboratory社よりTERTのfloxed mouseを購入し、Addgene社よりCreを発現するAAVウイルスベクターを購入した。マウスの背側海馬歯状回にベクターを局所注入し、1か月後にかん流固定して海馬を含む脳切片でTERTの免疫染色を行った。その結果、海馬歯状回の顆粒細胞層を中心としてTERT陽性細胞が減少している様子が観察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
3WFSラットの海馬でのβ-cateninのタンパク量低下が核でのTERTの転写を低下させるかどうか確認するために、核分画のβ-catenin量を分離して定量する必要がある。そのための予備的検討を行ったところ、細胞分画の方法はほぼ確立できた。
一方、今年度の検討でマウス海馬におけるTERTのコンディショナル・ノックアウトの作成に成功した。来年度は上記の確立した方法を用いて、さらに検討を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度は、本年度に確立した細胞分画の方法を用いて、コントロール群と3WFSラット群の海馬を比較し、3WFS群でβ-cateninの核移行量が低下していることを確認する。また、β-cateninの免疫染色を行い、これと平行した所見が得られるかどうか検討する。そして、核移行したβ-cateninが実際にTERT遺伝子の調節領域に結合しているかどうか確認するため、3WFSラットの海馬サンプルを用いてβ-catenin抗体によるクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-Seq）を行う。
一方、本年度に確立した海馬におけるTERTのコンディショナル・ノックアウトマウスに対して、行動量および不安行動（高架式十字迷路）、うつ行動（強制水泳）、記憶（新奇物体試験）、注意力およびワーキングメモリー（Y迷路試験）を調べる行動試験を行い、海馬神経細胞におけるテロメア短縮が脳機能に及ぼす影響について検討する。
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