| 研究課題/領域番号 |
22K07626
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52030:精神神経科学関連
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
尾之内 高慶 藤田医科大学, オープンファシリティセンター, 講師 (20632954)
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| 研究分担者 |
塩竈 和也 藤田医科大学, 医療科学部, 准教授 (10387699)
酒井 一由 藤田医科大学, 保健学研究科, 准教授 (90215583)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
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| キーワード | APC / 小脳 / ゴルジ染色解析 / 光-電子相関顕微鏡解析 / 免疫電顕解析 / 免疫染色 / 神経ネットワーク / 光-電子相関顕微鏡法 / 統合失調症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
大腸癌抑制遺伝子として発見されたApc遺伝子は、大腸や脳(海馬,小脳)に多く発現している。脳に発現するApc遺伝子の機能はよく分かっていない。癌が発生しない変異APC(APC1638T)を発現するAPC1638Tマウスは、海馬神経細胞のシナプス形成と伝達に異常があり、統合失調症様行動を示す。小脳に発現するApc遺伝子の機能はよく分かっていない。本研究の目的は、APC1638Tマウス小脳における「三次元神経ネットワーク構造」と「APCとPSD-95（APC結合タンパク質）の局在」を調べて、APCとPSD-95の相互作用が小脳の三次元神経ネットワーク形成に与える影響を明らかにすることである。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、APC1638Tマウス小脳における「三次元神経ネットワーク構造」と「APCとPSD-95（APC結合タンパク質）の局在」を調べて、小脳の三次元神経ネットワーク形成におけるAPCとPSD-95の相互作用を明らかにすることを目的としている。
2023年度は、下記の実験を行った。①野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳組織の採取を行った。4%パラホルムアルデヒドで潅流固定と浸漬固定を行った後、ビブラトームを用いて厚さ100μmの浮遊切片と、ミクロトームを用いて厚さ3μmのパラフィン切片を作製した。②厚さ100μmの浮遊切片を用いて、単一神経細胞を染色するゴルジ染色の染色条件の検討を行った。厚さ3μmのパラフィン切片を用いて、共焦点レーザー顕微鏡と走査電子顕微鏡で同じ場所を観察する光-電子相関顕微鏡法の実施方法の検討を行った。③免疫電顕解析で用いるマウス小脳の樹脂ブロックを作製した。野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳組織を4%パラホルムアルデヒドと0.1%グルタルアルデヒドの混合固定液で浸漬固定した後、1%四酸化オスミウムで浸漬固定して、エポン樹脂に包埋した。
2024年度は、①野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳組織の採取、②2023年度の実験から得られたゴルジ染色の最適な染色法や確立された光-電子相関顕微鏡法を行い、野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの三次元神経ネットワーク構造を観察して、両マウス間の違いを明らかにする。また、③免疫電顕解析における免疫染色の染色条件（抗原賦活条件, 抗体希釈条件）の検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2022年度と2023年度の実験より、免疫染色の最適な染色条件,ゴルジ染色の最適な染色法, 確立された光-電子相関顕微鏡法のプロトコール情報を得ることができた。しかし、まだ野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳における三次元神経ネットワーク構造を観察して、両マウス間の違いを明らかにできていない。このことから、本研究課題の現在までの進捗状況を「やや遅れている。」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2024年度は、①野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳組織の採取、②2023年度の実験から得られたゴルジ染色の最適な染色法や確立された光-電子相関顕微鏡法を行い、野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの三次元神経ネットワーク構造を観察して、両マウス間の違いを明らかにする。また、③免疫電顕解析における免疫染色の染色条件（抗原賦活条件, 抗体希釈条件）の検討を行う予定である。
上記の①に関しては、マウス繁殖が順調に進めば、本研究に必要な数の野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの小脳組織が得られると思われる。
上記の②に関しては、野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの三次元神経ネットワーク構造を観察する顕微鏡観察時間を確保できれば、両マウス間の違いを明らかにすることができると思われる。
上記の②に関しては、免疫電解析に用いる試薬が予定通りの時間で納品されれば、染色条件（抗原賦活条件, 抗体希釈条件）の検討結果を明らかにすることができると思われる。
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