| 研究課題/領域番号 |
22K07766
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52040:放射線科学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
善光 純子 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任助教 (20710148)
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| 研究分担者 |
鈴木 絢子 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (00770348)
鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | アブスコパル効果 / 放射線治療 / 抗腫瘍免疫応答 / オミクス解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
腫瘍に対する局所放射線照射と免疫チェックポイント阻害剤の併用治療に伴って全身で起こる抗腫瘍免疫反応を制御することが、予後の改善に重要であることが示唆されている。
申請者がこれまでに行った、担癌マウスモデルにおける次世代シークエンス技術を用いたオミクス解析により、抗腫瘍免疫環境に影響を及ぼすことが示唆された遺伝子やsmall RNAについて、まずはin vitroでの機能解析を行うことにより、抗腫瘍免疫環境を改善する分子ターゲットまたは、予後予測につながるバイオマーカーの探索を行う。
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| 研究実績の概要 |
放射線治療後の抗腫瘍免疫反応を活性化させるために、治癒群と増悪群における免疫細胞を比較し、新たなターゲット分子を見出すために下記の実験を進めている。C57BL/6マウスの大腿皮下にGL261腫瘍細胞を移植した担癌マウスを作成し、腫瘍局所に10Gyの放射線を照射した後、2群に分け、一方に抗PD-1抗体を3回投与した。その後両群の頭蓋内に同じ腫瘍細胞を再移植した。両群から10日以上の間隔をあけて経時的に採血し、調製したPBMCを用いてシングルセルトランスクリプトーム解析を実施し遺伝子発現変化を解析している。さらに遺伝子発現変動がDNAのメチル化による制御を受けているかを確認するために、治癒群・増悪群から各1匹ずつ選択し、調製したPBMCを用いて、EM-Seq法によるDNAのメチル化解析を開始した。
シングルセルトランスクリプトーム解析からは、腫瘍が縮小したマウスの腫瘍治癒後では、赤芽球の異常な増加が見られており、ヘモグロビン遺伝子発現の顕著な上昇が認められた。また、治癒群と増悪群を比較すると多くのリボソームタンパク質とAlas2、Eef2、Hspa8、Fam220a、Nacaなどの発現に違いが見られた。
同じマウスの治療直後のPBMC解析では、腫瘍が縮小しつつあるマウスでは、まだ赤芽球の増加は見られておらず、両群間ではJund、Gnas、Arf6、Pcbp1などの遺伝子発現に違いが見られた。
EM-Seqの結果については、現在解析を進めているところであるが、これまでのところ、トランスクリプトーム解析において発現に違いが認められた遺伝子について、DNAメチル化による制御を受けていると思われる遺伝子は見つかっていない。
今後はシングルセルトランスクリプトーム解析で変化があった遺伝子等について、細胞を用いた機能解析を実施する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスPBMCのシングルセルトランスクリプトーム解析について、治癒群と増悪群で全PBMCの経時的な遺伝子発現変化についてデータ解析を実施し、治療予後により、または種々の処理によって経時的に発現に差がみられる遺伝子を確認することができた。これらの遺伝子については、今後、どのような機能の遺伝子が変化しているのかをオントロジー解析・パスウェイ解析等により解明する。
また、その制御機構を解明するためにPBMCからDNAを調製し、DNAのメチル化解析用のライブラリをEM-Seq法により調製し、シークエンスを完了した。今後は、得られたシークエンス結果のデータ解析により、両群間でメチル化の状態に差が見られる遺伝子の抽出を実施し、トランスクリプトーム解析で得られた発現変化と相関があるかどうかを確認し、続いて実施するヒト細胞を用いた機能解析に進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
放射線治療を施したマウスから得たPBMCを用いたシングルセルトランスクリプトーム解析の結果から、治癒群と増悪群の比較で発現に差が認められた遺伝子について、DNAのメチル化による遺伝子発現の制御がされているかどうかの解析を進める。EM-Seq法によりマウスPBMCからシークエンス用ライブラリを調製し、シークエンス解析まで完了している。今後は、シングルセルトランスクリプトーム解析の結果と比較して、メチル化による制御を受けていることが予想される遺伝子を確認する。また、メチル化の違いを検出できるプラットフォームであるmetileneやmethylKitなどを用いて、治癒群と増悪群でメチル化に差が見られる遺伝子の解析を進める予定である。
また、シングルセルトランスクリプトーム解析からPBMC全体で遺伝子発現に差異が見られた遺伝子については、ヒトPBMCとヒト培養肺癌細胞を用いたin vitroでの機能の検証実験を実施する予定である。発現の差が見られた遺伝子に対する抗体等を濃度や反応時間を変化させてヒトPBMCに作用させる。また腫瘍細胞として使用するヒト肺腺癌細胞A549細胞を破砕もしくは、UV照射やアルキル化剤添加により処理したものを、腫瘍抗原としてPBMCに作用させる。腫瘍抗原と抗体等で処理したPBMCをA549細胞に加えて、その抗腫瘍反応を比較することにより、PBMCの腫瘍に対する免疫反応を、より効率的に惹起するためには、どのような遺伝子の変化が必要であるかを検証していく。
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