新規ベクターを用いた血液系遺伝病の安全なゲノム編集治療技術の開発

• 研究課題/領域番号: 22K07852
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: プライム編集 / ゲノム編集 / アデノウイルスベクター / iPS 細胞 / prime editing / ウイルスベクター / SCID-X1

研究開始時の研究の概要

prime editing（PE）は、染色体を切断せずかつ鋳型DNAを必要としない、新規の安全なゲノム編集技術である。しかし、既存のウイルスベクターで運ぶにはPEの遺伝子サイズが大きすぎるため、高効率な遺伝子導入・発現が喫緊の課題である。本研究では、容量が大きくかつ高発現を得ることが出来る新世代型ベクターの有用性を検証する。1) レポーター遺伝子を用いた血液系細胞株におけるPEの至適化と、2) ヒト造血幹前駆細胞におけるIL2RG遺伝子座のPEによる修復の後に、3) PE処理したヒト免疫不全症モデルマーモセット骨髄細胞のマウスへの移植実験で、造血幹細胞レベルでの治療効果と安全性の検証を行う。

研究実績の概要

アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。
PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。
これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。
感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。
しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

改良型として、PE4遺伝子発現とepegRNA発現のベクターを別途構築した。また、PE4遺伝子発現ベクターの産生上の問題を克服するため、デザインを工夫した新たなベクターを構築し、高力価で調整した。
それらのベクターを用いて様々な細胞でPE実験を行った。K562細胞ではまだ実験は行っていないが、A549細胞やHepG2細胞で、目的の90%を越える効率でのPEに成功した。

今後の研究の推進方策

2022年度はAd5血清型のベクターを調整したが、造血細胞にも感染できるようにAd35血清型のヘルパーウイルスでベクターを調整する。
K562細胞とヒトCD34陽性造血幹前駆細胞を標的として、先ず変異Venusを標的としたPEを行う。それに引き続き、治療標的遺伝子であるIL2RG遺伝子座のexon2を修復するprime editingを行う。