| 研究課題/領域番号 |
22K07941
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
桑原 康通 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30590327)
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| 研究分担者 |
奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | SWI/SNF複合体 / ラブドイド腫瘍 / RUNX1 / TRKA |
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| 研究開始時の研究の概要 |
悪性ラブドイド腫瘍（malignant rhabdoid tumor：以下MRT）は1歳未満の乳幼児の主に脳や腎臓に発生するきわめて予後の悪い小児固形腫瘍である。ヒト腫瘍の発生には一般に複数のゲノム遺伝子変異の蓄積を必要とするが、MRTは、ゲノム上ただ一つのSNF5遺伝子変異によって発症すると考えられているユニークな腫瘍である。最近、MRTが神経堤細胞起源である可能性が示された。そこで本研究では、神経堤細胞の発生分化の観点から、クロマチンリモデリングとMRT発生との関わりを検討し、SNF5欠損によるエピジェネティクス発がん機構の解明と、新規治療戦略の確立を目指している。
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| 研究実績の概要 |
悪性ラブドイド腫瘍（MRT）の発生機序は不明であるが、最近の研究により、MRT細胞は神経堤細胞と関連していることが報告された。SNF5の発現を抑制することによって、神経成長因子（NGF）による神経分化を阻害することが分かった。このことから、SNF5欠損したMRTには、神経分化プログラムの不全があると考えられ、神経堤細胞の発生分化とMRT発生の関係を検討する。具体的には、NGFはTRKA受容体を介し交感神経の発生に寄与し、またTRKA受容体の転写にRUNX1が関与することも報告されていることからから、MRT細胞や他の細胞株での、SNF5やRUNX1の発現によるTRKA遺伝子の転写制御について検証した。最初に、RUNX1、SNF5発現ベクターを用いて、MRT細胞株（A204細胞）にRUNX1やSNF5遺伝子を導入し、TRKA遺伝子のmRNAをリアルタイムPCRで評価した。SNF5の導入によってTRKAのmRNAが上昇したことから、SNF5の欠損によってTRKA受容体の転写が影響されたが、RUNX1単独では上昇しなかった。続いて、TRKA遺伝子のプロモーターを3種類の長さで組み込んだルシフェラーゼアッセイベクターを作成し、HeLa細胞と MRT細胞株（A204細胞）へ導入し、RUNX1やSNF5の発現による影響を検証したところ、RUNX1やSNF5遺伝子の導入によって、ルシフェラーゼ活性は上昇した。したがって、TRKA遺伝子のプロモーターの転写活性にはSNF5が重要であり、RUNX1も影響することが示された。これらの結果から、RUNX1とSNF5はTRKA遺伝子の発現に関与していることが示唆され、SNF5の欠損したMRTの発生機序にも関与している可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
以下の実験を本年度に実施することができた。
１：SNF5欠損のMRT細胞株（A204細胞）へSNF5を導入し、RUNX1やTRKAの発現への影響を検討することを行った。RUNX1、SNF5発現ベクターを用いて、MRT細胞株（A204細胞）にRUNX1やSNF5遺伝子を導入し、TRKA遺伝子のmRNAをリアルタイムPCRで評価した。SNF5の導入によってTRKAのmRNAが上昇したことから、SNF5の欠損によってTRKA受容体の転写が影響されたが、RUNX1単独では上昇しなかった。
２：TRKA遺伝子プロモーターにおけるRUNX1の機能解析とSNF5欠損の影響について、3種類の長さのTRKA遺伝子のプロモーターを組み込んだルシフェラーゼアッセイベクターを作成することは終了した。HeLa細胞に、導入しRUNX1によるTRKA遺伝子の転写制御を検討したところ、TRKA遺伝子プロモーターの活性は、RUNX1の発現によって上昇した。同様の実験を、SNF5を導入したMRT細胞株（A204細胞）を用いて検討した。結果、SNF5の導入によってTRKA遺伝子のプロモーターの転写活性は上昇した。しかし、驚いたことに、RUNX1単独でもSNF５の場合よりも弱いものの、ルシフェラーゼ活性は上昇した。また、一番短いプロモーター領域を導入したルシフェラーゼベクターでも転写活性上昇したことから、RUNX1は転写開始点に近い領域で機能していることが示唆された。以上から、TRKA受容体の転写活性にSNF5は重要な役割をしていること、さらにRUNX1も転写機構に関与していることが示唆される結果を得た。以上のように、当初の計画通り研究は進捗していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経芽腫細胞株IMR32などのSNF5ノックアウト細胞株を作製し、SNF5欠損がTRKA遺伝子の発現に与える影響を解析する予定である。また、TRKA遺伝子プロモーター上でRUNX1がどの位置に関係して機能するかは未解明である。そこで、次の２つの手法を用いて検討することを計画している。１つ目は、クロマチン免疫沈降法（ChIPアッセイ）を行い、RUNX1やSNF5がどのようにTRKA遺伝子プロモーターにリクルートされるかを確認する。２つ目は、ルシフェラーゼベクターに挿入したTRKA遺伝子プロモーターのRUNXコンセンサス配列を変異させ、RUNX1のTRKA遺伝子プロモーター上での挙動を検討する。さらに、SNF5とRUNX1のタンパク間相互作用は既に我々が確認しているところであるが、MRTに存在する新しいSWI/SNF複合体であるncBAFについても、その構成因子であるBRD9とRUNX1との相互作用を検討したいと考えている。これらの手法によって、SNF5欠損がTRKA遺伝子の発現制御に与える影響やRUNX1とncBAFの関連性について検討を進め、MRT発生に関する新たな知見を得られることを期待しているところである。
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