１型高IgE症候群に対する塩基編集と変異アレルの除去による新規遺伝子治療法の開発

• 研究課題/領域番号: 22K07951
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
• 研究機関: 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
• 研究代表者: 内山 徹 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, 室長 (10436107)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 遺伝子治療 / ゲノム編集 / 高IgE症候群 / STAT3

研究開始時の研究の概要

I型高IgE症候群（HIES）はSTAT3の片アレル変異によるドミナントネガティブ効果によって発症する原発性免疫不全症である。生理的な遺伝子発現制御の必要性や、残存する変異アレルによるアレルギー・炎症性病変の可能性から従来のウイルスベクターによる付加型遺伝子治療では対応が難しいとされる。本開発ではこれらの課題を克服すべく、①dead Cas9（dCas9）とtRNAアデノシンデアミナーゼ（Tad）からなる塩基編集ツールによる変異の修復と、②残存する変異アレルへのindel挿入、を組み合わせることで、変異の修復を同時に残存変異アレルの除去によるHIESへの新規の遺伝子治療法の開発を試みる。

研究実績の概要

I型高IgE症候群（HIES）はSTAT3の片アレル変異によるドミナントネガティブ効果によって発症する原発性免疫不全症である。生理的な遺伝子発現制御の必要性や、変異アレルによるアレルギー・炎症性病変の可能性から従来のウイルスベクターによる付加型遺伝子治療では対応が難しいとされる。本開発ではこれらの課題を克服すべく、①dead Cas9（dCas9）とtRNAアデノシンデアミナーゼ（Tad）からなる塩基編集ツールによる変異の修復と、②残存する変異アレルへのindel挿入、を組み合わせることで、変異の修復を同時に残存変異アレルの除去によるHIESへの新規の遺伝子治療法の開発を試みる。
HIESでは、免疫機能の低下による易感染性の他、IgEや好酸球の増加を伴うアトピー性皮膚炎などの免疫異常が混在する。In vivoでの有効性評価のため、ヒトに該当するSTAT3変異を持つマウスを作製し、末梢血中のIgEと好酸球数の上昇のほか、皮膚刺激に対して容易に脱毛を越すことなどから、ヒトに近いフェノタイプを示すことがわかった。次に造血幹細胞へのゲノム編集のための造血幹細胞の培養方法およびゲノム編集ツールの導入のためのエレクトロポレーション法の最適化を行った。最適化した手法によって、８０％程度の効率で造血幹細胞へEGFP mRNAの導入が可能であった。また、変異アレルのみを認識・修復する必要があることから、変異アレル特異的な認識を可能にするガイドRNA配列を検討した。PAM配列がNGGおよびNGのCas9を用いて、複数のガイドRNAを検証したところNG-PAMを用いた場合に、変異アレル特異的なスペーサー配列を設計することが可能であった。
上記の条件を用いて、STAT3変異マウスの造血幹細胞に対して塩基編集ツールによる変異の修復を実施中である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

HIESでは免疫能の低下と免疫異常の両方が混在している。そのため、ゲノム編集を含めた遺伝子治療の有効性の評価には、細胞を用いた解析のみでは不十分であり、in vivoでの機能解析が必須である。昨年度までに作製したヒト（HIES患者）変異を持つマウスモデルでは、HIESの表現系を示すことがわかっており、このマウスを使用することで治療効果の評価が可能である。そのほか、治療効果が得られる効率でのゲノム編集を実施するためには、開発の各工程における条件の最適化が必須である。標的となる造血幹細胞の培養やゲノム編集ツールの導入方法は、ゲノム編集細胞のstemnessの維持に大きく影響する。また、HIESは常染色体顕性（優性）遺伝形式をとることから、健常アレルを壊すことなく、変異アレルのみを認識・編集するゲノム編集ツールの設計も必要となる。当該年度はHIESの造血幹細胞に対するゲノム編集に関わる様々な条件の最適化を完了し、次年度からこれらの条件によるゲノム編集の実施と有効性の評価を行っていく。

今後の研究の推進方策

造血幹細胞に対する変異アレル特異的なゲノム編集の条件検討が終了したことから、今後は作製したHIESマウスに対するゲノム編集を進めていく。血中のIgEの上昇、好酸球の増加、皮膚刺激による脱毛など、疾患特異的な所見も明確であることから、これらの改善を指標に有効性を評価することが可能である。

研究成果

• [雑誌論文] Pediatric Hemophagocytic lymphohistiocytosis after concomitant administration of SARS-CoV-2 vaccine and influenza vaccine. (2024)
  • 著者名/発表者名: Kaizuka A, Tokuda Y, Morooka S, Gocho Y, Funaki T, Uchiyama T, Hirai Y, Yasumi T, Maekawa T, Kubota M, Ishiguro A.
  • 雑誌名: J infect Chemother. 巻: 30(1) 号: 1 ページ: 67-70
  • DOI: 10.1016/j.jiac.2023.08.015
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Melting temperature mapping method in children: Rapid identification of pathogenic microbes. (2024)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T, Uejima Y, Okai M, Shiga K, Shoji K, Miyairi I, Kato M, Morooka S, Kubota M, Tagaya T, Tsuji S, Aoki S, Ide K, Niimi H, Uchiyama T, Onodera M, Kawai T.
  • 雑誌名: J Infect Chemother. 巻: 30(6) 号: 6 ページ: 475-480
  • DOI: 10.1016/j.jiac.2023.11.024
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Congenital anaemia associated with loss-of-function variants in DNA polymerase epsilon 1. (2024)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi I, Tanase-Nakao K, Ogawa A, Sugawara T, Migita O, Kashima M, Yamazaki T, Iguchi A, Naiki Y, Uchiyama T, Tamaoki J, Maeda H, Shimizu H, Kawai T, Taniguchi K, Hirata H, Kobayashi M, Matsumoto K, Naruse K, Hata K, Akutsu H, Kato T, Narumi S, Arai K, Ishiguro A.
  • 雑誌名: J Med Genet. 巻: 61(3) 号: 3 ページ: 239-243
  • DOI: 10.1136/jmg-2023-109444
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] HLA-haploidentical T-cell receptor αβT/B-cell-depleted stem cell transplantation for Fanconi anemia. (2024)
  • 著者名/発表者名: Iguchi A, Uchiyama T, Fujimori K, Gocho Y, Sakaguchi H, Deguchi T, Tomizawa D, Imadome KI, Onodera M, Matsumoto K.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 119(3) 号: 3 ページ: 334-337
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03703-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hematopoietic stem cell transplantation in two sisters with bone marrow failure associated with POLE gene variants. (2024)
  • 著者名/発表者名: Fujimori K, Ikenobe N, Gocho Y, Uchiyama T, Deguchi T, Sakaguchi H, Tomizawa D, Takeuchi I, Shimizu H, Arai K, Ishiguro A, Matsumoto K, Iguchi A.
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer. 巻: 71(5) 号: 5
  • DOI: 10.1002/pbc.30919
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A case of MYH7 and MYH9 genes variants with cardiomyopathy and macrothrombocytopenia. (2024)
  • 著者名/発表者名: Ikawa Y, Nakamura T, Fujino N, Uchiyama T, Ishiguro A, Takenaka M, Sakai Y, Noguchi K, Fujiki T, Wada T.
  • 雑誌名: Clin Case Rep. 巻: 12(2) 号: 2
  • DOI: 10.1002/ccr3.8304
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Measurement of immature platelet fraction is useful in the differential diagnosis of MYH9 disorders. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kouno H, Kunishima S, Takebe J, Uchiyama T, Kaname T, Ishiguro A.
  • 雑誌名: Int J Lab Hematol. 巻: 45(5) 号: 5 ページ: 700-706
  • DOI: 10.1111/ijlh.14123
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Peripheral immune system modulates Purkinje cell degeneration in Niemann-Pick disease tyepe C1. (2023)
  • 著者名/発表者名: Yasuda T, Uchiyama T, Watanabe N, Ito N, Nakabayashi K, Mochizuki H, Onodera M.
  • 雑誌名: Life Scie Alliance. 巻: 6(9) 号: 9 ページ: e202201881-e202201881
  • DOI: 10.26508/lsa.202201881
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Myelodysplasia after clonal hematopoiesis with APOBEC3-mediated CYBB inactivation in retroviral gene therapy for X-CGD (2023)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama T、Kawai T、Nakabayashi K、Nakazawa Y、Goto F、Okamura K、Nishimura T、Kato K、Watanabe N、Miura A、Yasuda T、Ando Y、Minegishi T、Edasawa K、Shimura M、Akiba Y、Sato-Otsubo A、Mizukami T、Kato M、Akashi K、Nunoi H、Onodera M
  • 雑誌名: Molecular Therapy 巻: 31 号: 12 ページ: 3424-3440
  • DOI: 10.1016/j.ymthe.2023.09.004
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Inherited macrothrombocytopenia due to a novel splice donor site mutation in ITGB3. (2023)
  • 著者名/発表者名: Komeno Y, Uchiyama T, Kawano F, Kurihara Y, Kurokawa M, Ohara O, Kunishima S, Ishiguro A.
  • 雑誌名: Ann Hematol. 巻: 102(10) 号: 10 ページ: 2947-2949
  • DOI: 10.1007/s00277-023-05387-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Safety and efficacy of elapegademase in patients with adenosine deaminase deficiency: A multicenter, open‐label, single‐arm, phase 3, and postmarketing clinical study (2023)
  • 著者名/発表者名: Onodera M, Uchiyama T, Ariga T, Yamada M, Miyamura T, Arizono H, and Morio T.
  • 雑誌名: Immunity, Inflammation and Disease 巻: 11 号: 7
  • DOI: 10.1002/iid3.917
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 造血幹細胞遺伝子治療―原発性免疫不全症 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 雑誌名: 日本医師会雑誌 巻: 第152巻（1） ページ: 248-252
• [雑誌論文] レトロウイルス、レンチウイルスベクター―特徴から臨床応用まで (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: Vol. 285 No5 ページ: 321-327
• [雑誌論文] 遺伝子治療開発研究ハンドブック 第1章 Ex vivo遺伝子治療, 第1節5. Genotoxicity. (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 雑誌名: 日本遺伝子細胞治療学会編集, 株式会社エヌ・ティー・エス. 巻: ‐
• [雑誌論文] 原発性免疫不全症候群 診療の手引き 第1章 複合免疫不全 B アデノシン・デアミナーゼ欠損症 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 雑誌名: 日本免疫不全・自己炎症学会編集, 診断と治療社 巻: -
• [雑誌論文] ゲノム編集の最新技術と医薬品・遺伝子治療・農業・水産物・有用物質生産への活用 第３章 遺伝子治療におけるゲノム編集技術の活用と課題対策 第5節 ゲノム編集技術による遺伝子治療の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 雑誌名: 技術情報協会 巻: -
• [学会発表] A sc-ddPCR vector tracing in ADA-SCID stem cell gene therapy. (2023)
  • 著者名/発表者名: Toru Uchiyama,
  • 学会等名: Bio-Rad Droplet Digital PCR World 2023.
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Gene-based monitoring in gene therapy for intractable diseases in Childhood. (2023)
  • 著者名/発表者名: Toru Uchiyama,
  • 学会等名: Bio-Rad Droplet Digital PCR World 2023.
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Gene therapy for inborn errors of immunity. (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第29回日本遺伝子細胞治療学会学術集会 シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Development of gene and cell therapy for intractable diseases in childhood. (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第29回日本遺伝子細胞治療学会学術集会 シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 小児希少疾患に対する遺伝子治療 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内山 徹
  • 学会等名: 第46回日本小児遺伝学会学術集会 特別企画シンポジウム
  • 招待講演