| 研究課題/領域番号 |
22K08013
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53010:消化器内科学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
今村 道雄 広島大学, 病院(医), 講師 (40403513)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 非アルコール性脂肪肝炎 / PNPLA3 / 遺伝子編集 / ゲノム編集 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
リスクアレルを有するPNPLA3あるいはTM6SF2遺伝子のヒト肝細胞を移植マウスにフルクトース含有高コレステロール食を給餌させ、ヒトNASHに極めて類似したモデルを作成する。NASHモデルマウスにアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにCas9システムを挿入したAAV-Cas9を経静脈的に投与し、肝細胞内にPNPLA3あるいはTM6SF2遺伝子を標的としたgRNAを発現させ、これら遺伝子を非リスクアレルにゲノム編集することで、NASH病態の改善を試みる。
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| 研究実績の概要 |
非アルコール性脂肪肝炎（NASH）患者の疾患進行に関係する一塩基多型（SNP）であるPNPLA3-I148M変異は、疫学研究において肝臓の脂肪化や線維化、HCCのリスクを上昇させることが報告されている。マウスモデルで肝脂肪および線維化についての報告があるが、ヒト肝細胞ではこのような実験データは示されていないため、遺伝子編集を用いて病態モデルを確立することを試みた。従来のCRISPR-CAS9システムではオフターゲットの影響が強く、In-delを生じる可能性があるが、Prime editingはDNAおよびRNAでのオフターゲット効果の低下が期待できるため、これを用いてPNPLA3 rs738409の遺伝子編集を試みることとした。Prime Editor プロトスペーサ標的の選定を行い、rs738409編集用Prime Editingベクター（pegRNA/epegRNA/ngRNA）を作製した。これらのシステムとPE5を組み込み、GFPをP2A配列で結合させたオールインワンプラスミドを開発した。Poly-L-Lysineコートした96well plateにHEK293T細胞を15000/well撒き、同日90 ng/wellのLipofectamin LTXを用いてtransfectionさせた。72時間後に蛍光顕微鏡でGFPが発現し、transfection成功が期待される細胞が存在していることを確認した。トリプシンで細胞を剥がし、DNeasy Blood & Tissue Kit でDNAを抽出した。PCRで増幅し、ゲル精製後BigDye Terminator v3.1を用いてseq PCRを行った。ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzerでシークエンスを確認すると、標的部位に43％のC to Gの編集が起こっていた。
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