ノックインマウスを用いた血漿カリクレイン依存的TGF-β活性化と肝線維化の解析

• 研究課題/領域番号: 22K08067
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53010:消化器内科学関連
• 研究機関: 東京慈恵会医科大学
• 研究代表者: 古谷 裕 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80392108)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 肝線維化 / 肝がん / TGF-β / ノックインマウス / 血漿カリクレイン

研究開始時の研究の概要

初期の肝線維化において、セリンプロテアーゼである血漿カリクレイン(PLK)によるTGF-β前駆体であるLAPの切断がTGF-βの活性化を誘導することを見出した。PLK依存的なTGF-β活性化がどの様に肝線維化と肝がんに関与しているのか明らかとなっていない。当申請課題ではPLKによるLAP切断部位に変異を導入し、切断できない配列を持つノックインマウスを用い、肝線維化モデルと肝がんモデルを作製し、PLK依存的なTGF-β活性化の役割を明らかにすることを目的とする。

研究実績の概要

TGF-βが血漿カリクレインにより切断され活性化することを我々の研究グループでは見出している。この切断はTGF-βの前駆体であるLAPのArg58, Leu59の間で起き、LAPのN末側が細胞外マトリックス残り、C末側が血中に放出され、初期の肝線維化を検出するマーカーとして有用なことが解っている。しかし、血漿カリクレイン依存的なTGF-βの活性化が肝線維化と肝がんにおいて果たす役割は不明のままであった。そこで、LAP切断部位Arg58, Leu59をAla58, Ala59に置換した変異を導入することにより切断できない配列を持つノックインマウスを作製しライン化した。このノックインマウスを用いて胆管結紮モデルを作製し、肝線維化マーカーであるコラーゲンタイプIと活性化型肝星細胞のマーカーであるαSmooth muscle actin (αSMA)の発現量を解析した。その結果、コラーゲンタイプIとαSMAは胆管結紮３日目では発現量に差はなかったが、胆管結紮１３日目では野生型マウスと比較してノックインマウスで有意に減少していることが明らかとなった。従って、これまで解析したALT、ASTに加え肝線維化マーカーの遺伝子発現もノックインマウスにおいて抑制されていることが示された。ノックインマウスのライン化を行ったので、ノックインマウス同士の掛け合わせにより肝線維化・肝がんモデルマウスを作製するための十分な匹数を確保できるようになった。脂肪肝炎モデルを作製しており、肝線維化マーカーの解析を行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ライン化したノックインマウスの自然交配により実験に用いるマウスを確保できるようになっており、肝線維化モデルの作製を進めているため。

今後の研究の推進方策

ノックインマウスをライン化し、ノックインマウス同士の自然交配により実験に用いるマウスを十分確保できるようになった。今後これらのマウスを用いて、脂肪肝炎モデル、四塩化炭素による肝線維化モデル、ジエチルニトロサミン(DEN)による化学発がんモデルを作製し、血漿カリクレイン依存的なTGF-βの活性化と肝線維化、肝がんとの関連を調べる。

研究成果

• [雑誌論文] Corn Oligopeptide Alleviates Nonalcoholic Fatty Liver Disease by Regulating the Sirtuin Signaling Pathway (2024)
  • 著者名/発表者名: Xu Yali、Su Ting、Mishra Hricha、Ando Reiko、Furutani Yutaka、Lu Jun、Cai Muyi、Suzuki Harukazu、Yu Wenkui、Qin Xian-Yang
  • 雑誌名: Journal of Agricultural and Food Chemistry 巻: 72 号: 12 ページ: 6360-6371
  • DOI: 10.1021/acs.jafc.3c09058
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Targeting transglutaminase 2 mediated exostosin glycosyltransferase 1 signaling in liver cancer stem cells with acyclic retinoid (2023)
  • 著者名/発表者名: Qin XY, Furutani Y, Yonezawa K, Shimizu N, Kato-Murayama M, Shirouzu M, Xu Y, Yamano Y, Wada A, Gailhouste L, Shrestha R, Takahashi M, Keillor JW, Su T, Yu W, Fujii S, Kagechika H, Dohmae N, Shirakami Y, Shimizu M, Masaki T, Matsuura T, Suzuki H, Kojima S
  • 雑誌名: Cell Death & Disease 巻: 14 号: 6 ページ: 358-358
  • DOI: 10.1038/s41419-023-05847-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A small molecule iCDM-34 identified by in silico screening suppresses HBV DNA through activation of aryl hydrocarbon receptor (2023)
  • 著者名/発表者名: Furutani Y, Hirano Y, Toguchi M, Higuchi S, Qin XY, Yanaka K, Sato-Shiozaki Y, Takahashi N, Sakai M, Kongpracha P, Suzuki T, Dohmae N, Kukimoto-Niino M, Shirouzu M, Nagamori S, Suzuki H, Kobayashi K, Masaki T, Koyama H, Sekiba K, Otsuka M, Koike K, Kohara M, Kojima S, Kakeya H, Matsuura T
  • 雑誌名: Cell Death Discovery 巻: 9 号: 1 ページ: 467-467
  • DOI: 10.1038/s41420-023-01755-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 血漿カリクレイン依存的なTGF-β前駆体の切断を指標とした肝線維化マーカーの開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 古谷 裕、政木隆博、松浦知和、越智小枝
  • 学会等名: 第６３回日本臨床化学会年次学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 血漿カリクレイン依存的なTGF-β1活性化を阻害したノックインマウスを用いた肝線維化機構の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 古谷 裕、屋中香織、松浦知和
  • 学会等名: 第３９回肝類洞壁細胞研究会