細胞膜脂質の“質”的な環境変化による難治性肺疾患形成メカニズムの解明

• 研究課題/領域番号: 22K08229
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53030:呼吸器内科学関連
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 高宮 里奈 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (70365419)
• 研究分担者: 齋藤 充史 札幌医科大学, 医学部, 講師 (00768939)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: ホスファチジルコリン / ミトコンドリア / Nrf2 / 肺癌 / リピドミクス解析 / 小胞体 / コリン / リン脂質 分解酵素 / II 型肺胞上皮細胞 / 肺線維症 / 肺がん

研究開始時の研究の概要

肺サーファクタントの分泌や肺胞上皮の複製を担うATII細胞の形態異常は、様々な難治性呼吸器疾患と関連すると考えられている。しかしながら、ATII細胞の形態変化は複雑で、細胞膜脂質の調節機構は十分に理解されていない。 最近申請者は、PNPLA 6 の発現がATII細胞やがん細胞の形態変化に寄与する機能分子である可能性を示す知 見を得ている。そこで本申請研究案では PNPLA6 の機能に着目し、難治性肺疾患マウスモデルや肺がん細胞株を用い細胞形態変化を脂質の網羅的解析から検証し、細胞膜脂質の“質”の変化の分子機構を詳らかにすることで、新たな治療戦略につながる基盤研究を推進したい。

研究実績の概要

今年度は、PNPLA6の細胞内における発現部位について検証を行った。昨年度の結果より、PNPLA6はendoplasmic reticulum (ER)よりもcrude mitochondriaに発現が高いという知見を得ていた。そこでHEK293細胞を用い、crude mitochondriaから、さらにpure mitochondria, mitochondria associated ER membrane (MAM)に分画し、western blotを行ったとところ、PNPLA6の発現はMAMに高いことがわかった。
そこで次に、HEK293 PNPLA6ノックアウト細胞を作成し、whole cell及び、crude mitochondriaを用いリピドミクス解析を行った。その結果、whole cellでは一部のホスファチジルコリン(PC), Lyso-PCの産生の増加が、ノックアウト細胞で認められていたが、crude Mitoを分画し解析を行うと、ほとんどのホスファチジルコリン(PC), Lyso-PCの分子種が野生型に比べノックアウト細胞では有意に増加していた。以上の結果より、PNPLA6はMAMに発現し、ミトコンドリア付近の細胞膜のリン脂質代謝を調節することによりがん細胞の性質に関与する可能性が示唆された。
次に各種がん細胞株を用いPNPLA6の発現を検証したところ、乳がん細胞株のうちTriple negativeであるMDA-MB231細胞、肺がん細胞株ではp53に変異を持つH157細胞やA549細胞で発現が高いことがわかった。PNPLA6のプロモーター領域上流に3ヶ所のAntioxidant responsive elementを持つことから、MDA-MB231、及びA549細胞でNrf2をsiRNAにてノックダウンするとPNPLA6の発現が一部低下することが分かった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

PNPLA6の発現部位の同定や、細胞を分画してリピドミクス解析を行い、細胞膜への異常を見出すことができた。また、PNPLA6の遺伝子発現調節機構に関する知見を得ることができた。

今後の研究の推進方策

mitochondria associated ER membrane (MAM)を含んだcrude mitochondriaを持ちたリピドミクス解析より、PNPLA6ノックアウト細胞では、ミトコンドリア周辺の細胞膜環境が著しく変化していること、また細胞増殖の遅延が認められることから、ミトコンドリアの異常が細胞老化に着目し検証を行うことを目的とする。
具体的には、これまで作製したHEK293細胞、MDA-MB231細胞、H157細胞、A549細胞でPNPLA6ノックアウト細胞とnon target細胞を用いミトコンドリアに障害を与え老化を引き起こすことが知られている抗がん剤であるドキソルビシンを添加し細胞への影響について、細胞死、細胞増殖、各種老化マーカーを用いたウェスタンブロットをおこぬことにより検証する。
また、PNPLA6の変異は網膜変性疾患や神経疾患に関わることが報告されている。そこで、各種PNPLA6変異体を作製し、HEK293　PNPLA6ノックアウト細胞に遺伝子導入し、代謝への影響、細胞のフェノタイプへの影響について検証を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Hepatic phosphatidylcholine catabolism driven by PNPLA7 and PNPLA8 supplies endogenous choline to replenish the methionine cycle with methyl groups (2023)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi T, Kawaguchi M, Harada S, Mouri M, Takamiya R, Miki Y, Sato H, Taketomi Y, Yokoyama K, Kobayashi T, Tokuoka SM, Kita Y, Yoda E, Hara S, Mikami K, Nishito Y, Kikuchi N, Nakata R, Kaneko M, Kiyonari H, Kasahara K, Aiba T, Ikeda K, Soga T, Kurano M, Yatomi Y, Murakami M
  • 雑誌名: Cell Rep 巻: 42 号: 2 ページ: 111940-111940
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111940
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Group IVE cytosolic phospholipase A2 limits psoriatic inflammation by mobilizing the anti‐inflammatory lipid N‐acylethanolamine. (2022)
  • 著者名/発表者名: Liang Luyiyun、Takamiya Rina、Miki Yoshimi、Heike Kanako、Taketomi Yoshitaka、Sugimoto Nao、Yamaguchi Midori、Shitara Hiroshi、Nishito Yasumasa、Kobayashi Tetsuyuki、Hirabayashi Tetsuya、Murakami Makoto
  • 雑誌名: The FASEB Journal 巻: 36 号: 5
  • DOI: 10.1096/fj.202101958r
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Segregated functions of two cytosolic phospholipase A2 isoforms (cPLA2α and cPLA2ε) in lipid mediator generation (2022)
  • 著者名/発表者名: Murakami M, Takamiya R, Miki Y, Sugimoto N, Nagasaki Y, Suzuki-Yamamoto T, Taketomi Y.
  • 雑誌名: Biochemical Pharmacology 巻: 203 ページ: 115176-115176
  • DOI: 10.1016/j.bcp.2022.115176
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] リン脂質分解酵素PNPLA6のがん化、細胞老化機構への関与 (2023)
  • 著者名/発表者名: 高宮里奈、村上誠
  • 学会等名: 第９６回日本生化学会大会
• [学会発表] 乾癬時増加する生理活性脂質(NAE)の産生機構と乾癬炎症抑制効果 (2022)
  • 著者名/発表者名: 高宮里奈、三木寿美、梁陸伊韻1、村上誠
  • 学会等名: 第９５回日本生化学会大会