| 研究課題/領域番号 |
22K08245
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53030:呼吸器内科学関連
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
平松 範子 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (10802209)
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| 研究分担者 |
山本 直樹 藤田医科大学, バイオリソース室, 教授 (00267957)
近藤 征史 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00378077)
今泉 和良 藤田医科大学, 医学部, 教授 (50362257)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 非小細胞肺癌 / 癌関連線維芽細胞 / CAF / 単球 / iPS細胞 / 血管内皮細胞 / 不死化細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
肺癌の治療薬として、新しい分子標的薬や免疫チェックポイント阻害剤などに期待が集まるが、治療効果は個人差が大きい。要因の１つとして、癌の浸潤・転移の環境を構築する「癌関連線維芽細胞(cancer associated fibroblast：CAF)」が考えられるが、CAFはheterogeneousな集団であり、詳細な分子機構は明らかではない。本研究は、非小細胞肺癌患者の末梢血単球由来iPS細胞から分化誘導した血管内皮細胞、線維芽細胞や免疫細胞、および癌組織から分離培養した癌細胞やCAFを用いて、分子間相互作用による癌増殖/浸潤メカニズムの解明とプレシジョン医療への応用をめざす橋渡し研究である。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、非小細胞肺癌（NSCLC）患者の癌組織から分離した癌細胞および癌関連線維芽細胞（cancer associated fibroblast：CAF）を培養して、iPS細胞作製技術を応用したCAFの由来細胞の検証、増殖制御可能なTet-On不死化技術を応用した特異的CAFマーカーの探索、遺伝子工学的なCAFマーカーの発現変化によるNSCLC細胞の増殖・浸潤への影響の検討、さらにiPS細胞由来リンパ球との共培養による癌細胞のviabilityに関するCAFの影響を検討して、プレシジョン医療への応用をめざす橋渡し研究である。
令和4年度の研究実績として、NSCLC患者の手術検体を材料として半年以上の継代維持が可能な癌細胞株の樹立、および同一患者の末梢血から単球を分離して単球由来iPS細胞（M-iPS細胞）の作製に成功した。このM-iPS細胞を血管内皮細胞および線維芽細胞に分化誘導し、セルカルチャーインサートを用いた癌細胞との共培養実験を行った。血管内皮細胞への分化誘導時に癌細胞と共培養することでCAFマーカーの1つであるα-SMA遺伝子の発現が増加した。癌細胞と共培養したM-iPS細胞由来血管内皮細胞を用いてin vitro血管チューブを形成させたところ、癌細胞と共培養していない条件に比べて、チューブ構造の分岐数が多く観察され、血管新生に関与するマーカーであるDLL4、LPAR4、LPAR6遺伝子の発現が増加した。また、癌細胞についてもM-iPS細胞由来血管内皮細胞と共培養することで、癌幹細胞マーカーであるEpCAM、CD44遺伝子の発現が増加した。
本結果より、癌細胞から分泌される液性因子により間接的に血管内皮細胞からCAFに形質転換される可能性が示唆された。また、血管内皮細胞およびCAFから分泌される液性因子が癌幹細胞の生存維持に関わる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度では、当初より予定していた、NSCLC患者の手術検体を材料とした癌細胞株の樹立と同一患者のM-iPS細胞の作製を実施し、M-iPS細胞から分化誘導した血管内皮細胞と線維芽細胞を用いた癌細胞との共培養実験によるCAFの由来細胞の検証を行うことができた。特にM-iPS細胞由来血管内皮細胞について、癌細胞から分泌される液性因子により間接的に血管内皮細胞からCAFに形質転換される可能性と、血管内皮細胞および形質転換されたCAFから分泌される液性因子が癌幹細胞の生存維持に関わる可能性を示唆する実験結果が得られた。
また、令和4～5年度に予定している、発現制御可能な不死化遺伝子導入CAFの作製およびCAFマーカーの探索に関する検討についても着手しており、現在、NSCLC患者の手術検体から分離したCAFにTet-On不死化ベクターを導入する実験を実施中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの成果から、癌細胞から分泌される液性因子により間接的に血管内皮細胞からCAFに形質転換される可能性と、血管内皮細胞および形質転換されたCAFから分泌される液性因子が癌幹細胞の生存維持に関わる可能性が示唆されたが、CAFとして証明するための細胞特性や詳細な分子機構についてさらなる検討が必要である。
令和5年度以降は、NSCLC患者の臨床材料から分離培養したCAFを用いて、増殖制御可能なTet-On不死化CAFを作製し、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析による特異的CAFマーカーを探索する。具体的には、いずれの解析を行うにおいても、in vitroでCAFの性質を変えずに大量に増殖させなければならないため、研究分担者の山本が作製した発現制御可能Tet-On不死化ベクターをCAFの偽attP領域に導入し、Dox添加培地でTet-On不死化CAFを大量に増殖させる。培地からDoxを排除して10日ほど培養した不死化OFFのCAFを用いて網羅的解析を実施し、既にCAFで検出されることが報告されているタンパク質（α-SMAなど）と合わせてCAF候補マーカーの遺伝子／タンパク質を選出する。不死化遺伝子のON/OFFによる発現差異を検証するため、α-SMA、FAP、S100A4、Meflinなどの発現についてフローサイトメトリーやウェスタンブロットを用いて解析する。またCAF候補マーカーの選出において、患者診療カルテ追跡も行い、特に予後が悪く、再発症例または抗癌剤抵抗症例から分離された培養増殖性が高いCAFの解析結果に重点を置きつつ絞り込みを行う。
CAF候補マーカーとしての評価は、対照として肺健常部から樹立または市販の健常線維芽細胞におけるマーカーの発現、さらに本学バイオリソース室の肺癌部と肺健常部の組織標本を用いて、CAF候補マーカーに対する免疫組織染色を行う。
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