| 研究課題/領域番号 |
22K08295
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53030:呼吸器内科学関連
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
岡本 安雄 川崎医科大学, 医学部, 教授 (80293877)
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| 研究分担者 |
竹之内 康広 川崎医科大学, 医学部, 講師 (30582233)
坪井 一人 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (80346642)
北風 圭介 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80840545)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 線維化 / 脂質メディエーター / 脂質メディエーター分解酵素 / 肺線維症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
特発性肺線維症は呼吸器疾患の中で最も予後不良な疾患で、その発症および進行メカニズムは明らかになっていないことから、新規治療法の開発は喫緊の課題である。本研究課題は、線維化促進因子と働く脂質メディエーターの分解という観点から肺線維化における脂質メディエーターの役割を明らかにすることを目的としている。また、本研究で得られる結果は、脂質メディエーター分解酵素を標的とした新しい肺線維症治療薬の基盤開発に繋がる可能性がある。
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| 研究実績の概要 |
「線維化肺では、スフィンゴシン1-リン酸（S1P）とリゾホスファチジン酸（LPA）の分解酵素脂質リン酸ホスファターゼ3（LPP3）の発現低下がS1PとLPAの蓄積を引き起こし、線維化を促進する。」という仮説を検証するために、組織特異的にLPP3を高発現するマウスおよび組換えアデノ随伴ウイルスゼロタイプ6（AAV6）.2FFの作製を行った。Rosa26遺伝子座にCAGプロモーター制御下で、Cre組換え酵素によりloxP配列に挟まれた発現阻止配列を除去するとLPP3を高発現するように遺伝子操作したLPP3ノックイン（LPP3-KI）マウスを2021年度に作製したが、Creマウスと交配後、Cre-loxPシステムによるLPP3の発現が認められなかった。用いた条件付きLPP3発現フラグメントから発現阻止配列内の不必要と考えられる箇所を削除し、約3 kbの条件付きLPP3発現フラグメントを作製した。2022年度文部科学省新学術領域先端モデル動物支援プラットフォーム・モデル動物作製支援を受け、CRISPR/Cas9を用いたノックイン技術を用いてマウスを作出した。計17匹が生まれ、生存した11匹のマウスの尾からゲノムDNAを抽出し、雄マウス1匹のみが挿入部位のN末およびC末のアウトサイドプライマーを用いたPCRで予想されるバンドが増幅されたことから、このマウスを候補マウスとした。また、作出された候補マウスとBL/6マウスを交配し、得られたLPP3-KIマウスから胎仔線維芽細胞を単離し、Cre組み換え酵素を導入することによりCre-loxPシステムによる発現阻止配列の除去の確認およびLPP3タンパク発現を確認した。肺に指向性の高いアデノ随伴ウイルスゼロタイプ6（AAV6）を用いた肺でLPP3を高発現するマウスを作製するために、肺でLPP3を高発現するAAV6.2FFを作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Rosa26遺伝子座にCAGプロモーター制御下で、Cre組換え酵素によりloxP配列に挟まれた発現阻止配列を除去するとLPP3を高発現するように遺伝子操作したLPP3ノックインマウスを2021年度に作製したが、Creマウスと交配後、細胞特異的なLPP3の発現が認められなかったため、2022年度にドナーベクターの再構築を行い、上記のマウスを再度作製したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度に作製した細胞特異的にLPP3を高発現するマウスあるいは経気管的に組換えAAV6.2FFを投与したマウスを用いて、LPP3遺伝子発現を促進する方法が肺線維症に有効な治療法となるか否かを明らかにする予定である。
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