PNHクローンの起源と変遷

• 研究課題/領域番号: 22K08452
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 高森 弘之 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (80792077)
• 研究分担者: 南谷 泰仁 東京大学, 医科学研究所, 教授 (60451811) ; 保仙 直毅 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10456923) ; 西村 純一 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教授 (80464246) ; 植田 康敬 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (30533848) ; 藤岡 龍哉 関西医科大学, 医学部, 准教授 (70403045) ; 松岡 由和 関西医科大学, 医学部, 助教 (70533420)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 発作性夜間ヘモグロビン尿症 / PNH / 血液疾患 / 全ゲノム解析 / 遺伝学的系統樹解析 / 系統樹

研究開始時の研究の概要

発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）の発症機序は、詳細不明である。造血幹細胞レベルでGPIアンカー型タンパク質の生合成に関わる遺伝子変異が生じると、PNHクローンが誕生する。その後一部の症例でPNHクローンが拡大し、PNHを発症する。本研究では、コロニー形成細胞アッセイ・全ゲノム解析・遺伝学的系統樹解析を組み合わせ、PNHクローン誕生からPNH発症までの遺伝学的プロファイルの軌跡を明らかにする。

研究実績の概要

本研究では、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）患者から得た単細胞レベルの全ゲノムシークエンスデータを用いて遺伝学的系統樹解析を行い、PNHクローンの発生から臨床的なPNH発症に至る過程を明らかにすることを目的としている。
本年度は、大阪大学大学院医学系研究科血液・腫瘍内科に通院中の2名のPNH患者の骨髄検体を用いて研究を行った。1名は、PIGA遺伝子変異に加えてHMGA2遺伝子変異を認める症例であり、もう1名は複数の異なるPIGA遺伝子変異が認められた症例である。患者から採取した骨髄細胞を単核球に分離し、フローサイトメトリーを用いて、造血幹細胞レベルの細胞集団をPNH分画（CD55/59陰性）とnon-PNH分画（CD55/59陽性）に分けた。次に、メチルセルロースを培地として、TPO、SCF、IL3などのサイトカインを用いてコロニー形成細胞アッセイで細胞増殖を行った。形成されたコロニーから、カラム法を用いてDNAを抽出した。それぞれのコロニーが隣接するコロニーとのコンタミネーションがない場合、単細胞を由来とする細胞集団と考えられるため、コロニーから得られたDNAも単細胞由来であるとして研究を行うことが可能である。DNAのクオリティーチェックを行い、次世代シークエンサーによる全ゲノム解析が可能なものを選択し、ライブラリー作成を行った。その後、次世代シークエンサーを用いて全ゲノム解析を実施し、全ゲノムシーケンスデータを取得した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

患者の骨髄細胞を用いて、コロニー形成細胞アッセイを行い、コロニーからDNAを抽出することができた。研究計画書の計画通りに進展していると考える。

今後の研究の推進方策

今後は、単細胞由来コロニーから得られた全ゲノムシークエンスデータを用いて、それぞれの患者の遺伝学的系統樹解析を行う。確認された体細胞遺伝子変異から系統樹の樹形を推定し、体細胞遺伝子変異を系統樹に割り付ける。血液細胞に生じる一塩基置換数は、経過した時間に相関することが報告されている。この原理を利用して、任意の遺伝子変異が生じた時期を推定することができる。また得られた系統樹から、合祖理論をもとに、有効細胞集団数の経過を推定することを試みる。臨床情報と統合することで、PNHクローンの誕生から疾患発症までのPNHクローンの拡大の軌跡を明らかにする。