| 研究課題/領域番号 |
22K08518
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター |
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研究代表者 |
勝見 章 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 病院, 部長 (80378025)
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| 研究分担者 |
田村 彰吾 北海道大学, 保健科学研究院, 准教授 (60722626)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | LOX / Rho family / 血小板 / 脂質シグナル / RhoA / フォルミン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
トロンビン、ADP、TXA2等の血小板膜上のアゴニスト受容体からのシグナル伝達はGα13を介してRhoAを活性化する。その結果、血栓形成に不可欠なプロセスである①血小板の形態変化②濃染顆粒内容物の分泌が起こる。我々は活性型RhoAに12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)が結合することを明らかにした。本研究ではFCγRIIaを介した血小板凝集においてRhoAが12-LOXの細胞膜への局在を介してPLCγ2活性を制御することを証明する。12-LOX結合蛋白の探索を同時に行うことで、本研究はヘパリン起因性血小板減少症を代表例とするFCγRIIaを介した病態に対する新たな抗血小板治療の基盤となりうる。
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| 研究実績の概要 |
血栓形成において血小板の粘着・顆粒からの内容物分泌・血小板凝集は不可欠なプロセスである。トロンビン、ADP、トロンボキサンA2(TXA2)等のアゴニスト受容体からの複数のシグナル伝達経路はGα13を介してRhoAを活性化する。その結果①血小板の形態変化②濃染顆粒内容物の分泌をおこす。血小板は止血血栓にとどまらず，動脈硬化・血管新生・炎症・アレルギー・がん転移等を含む種々の病態に関与している。この多機能性は血小板が数多くの生理活性物質を貯蔵・産生
し，活性化に伴って細胞外へ放出することと関連している。血小板細胞膜から遊離したアラキドン酸は、プロスタグランジン(PG)、ロイコトリエン(LT)等の生理活性物質に代謝される。PG、TXA2を生成するシクロオキシゲナーゼ(COX)とともに、血小板にはアラキドン酸を基質とするもう１つの酵素、リポキシゲナーゼ(LOX)が存在する。LOXには酸素付加部位の違いによって5-LOX、12-LOX、15-LOXが知られている。本研究ではRhoA-フォルミンが12-LOXの細胞膜への局在を介して血小板凝集に関与する可能性につき検討する。我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MSMS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。巨核球細胞株MEG-O1に活性型と不活性型RhoAを発現し、培養上清中の12-HETEを測定する実験系を確立し、RhoA活性の12-LOX機能への影響を調査中である。またGST-フォルミンによるアクチン重合アッセイを施行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。巨核球細胞株MEG-O1への発現系構築、12-HETE測定系、GST-フォルミンによるアクチン重合アッセイの立ち上げが行われている。以上のことから研究課題はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々はGTP結合型の活性型Rho family蛋白の一部にALOXが結合することを明らかにしており、さらにRhoA以外の複数の活性化Rho GTPasesとALOX family（5-LOX,12-LOX, 15-LOX)の結合の有無を検討する。次にGTP結合型Rho familyとALOXをCOS7細胞で共発現し、両者の直接結合を証明する。直接結合が認められない場合は既知のエフェクターを介した結合を証明する。また相互の結合に必要なドメインの同定を行う。GTPaseの阻害薬によるALOX下流脂質メディエーターの抑制効果の証明 ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子につきそれぞれの阻害剤(ボツリヌス毒素、RhoA 下流阻害剤Y-27632, Rac阻害剤NSC23766,Cdc42阻害剤ZCL278など)を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の定量を行う。
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