| 研究課題/領域番号 |
22K08725
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分55010:外科学一般および小児外科学関連
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| 研究機関 | 日本赤十字社和歌山医療センター(臨床研究センター) |
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研究代表者 |
金井 理紗 日本赤十字社和歌山医療センター(臨床研究センター), 小児外科部, 医師 (50935947)
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| 研究分担者 |
木下 和生 静岡社会健康医学大学院大学, 社会健康医学研究科, 教授 (50293874)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2025年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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| キーワード | 炎症性腸疾患 / 腸閉鎖 / TTC7A / TTC7B / SW620 / LoVo / 小児 / リン脂質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
最近、先天性腸閉鎖症、炎症性腸疾患を伴う遺伝性疾患である「腸管異常免疫不全症 GIDID」の原因遺伝子TTC7Aが同定されたが、有効な治療法はまだ存在しない。TTC7Aには遺伝子重複により似たような働きをもつTTC7Bという遺伝子が存在する。TTC7Aが欠損しているGIDIDに対して、代わりにTTC7Bの発現誘導により機能を補う新しい遺伝子治療の可能性についてヒト腸上皮細胞を用いて検討する。細胞株を用いてTTC7AおよびTTC7Bのダブルノックアウト実験で機能的冗長性の存在を証明し、更にエピゲノム編集を用いて、TTC7B発現によりTTC7A欠損細胞が正常に近づくかどうかを調べる。
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| 研究実績の概要 |
1. 内在性TTC7B遺伝子のC末端にmAIDとGFPを付加するノックインの結果
SW620細胞株と、前年度作成したTTC7A欠損SW620細胞株に、TIR（auxin-inducible degron (AID)を認識して分解するタンパク）遺伝子を導入し、安定発現細胞株を樹立した。その細胞に前年度作成したTTC7BのC末端にAIDドメインを付加するためのtargeting vectorを、TTC7B遺伝子を標的としたCRISPR-Cas9とともにlipofectionで遺伝子導入した。targeting vectorの上流と下流でPCRを行い、相同組み換えが確認できた細胞が9クローン得られた（SW620細胞株由来が8クローン、TTC7A欠損SW620細胞株由来が1クローン）。しかしTTC7BのC末端にGFPを付加したこれら9クローンはGFPを発現していないことが判明し、GFPを指標にタンパクの局在と分解をモニタリングする計画は実現できないことがわかった。そのため方針を変更することとした。
2. Cre-loxPを用いたConditional knockout
次にTTC7Bのexon 8の上流と下流にloxP部位をCRISPR-Cas9で導入し、Cre組み換え酵素の一過性発現によりexon 8（64塩基対）を欠失させることを試みた。欠失によりexon skippingが起こると、フレームシフトによるTTC7Bタンパクの欠損が起こると予想された。SW620細胞株と、TTC7A欠損SW620細胞株にloxPを含むオリゴとexon 8上流をターゲットとするCRISPR-Cas9タンパクを電気穿孔法（4D-Nucleofector）により導入した。その結果、55クローン中7クローンにhomozygous挿入が確認された。今後exon 8の下流にloxPを導入する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
内在性TTC7B遺伝子のC末端にmAIDとGFPを付加するノックインを行うことでGFPを指標にタンパクの局在と分解をモニタリングする計画であったが、GFPが発現していないことが判明し、研究デザインの方針をCre-loxPを用いたConditional knockoutに変更したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cre-loxPを用いたConditional knockoutを進める。現在TTC7Bのexon 8の上流にloxP部位をCRISPR-Cas9で導入できており、今後exon 8の下流にも導入予定である。これが得られれば、Cre組み換え酵素の一過性発現によりexon 8を欠失させ、フレームシフトによるTTC7Bタンパクの欠損を起こすことができるようになる。それにより細胞死が起こる結果が得られれば、合成致死を起こすことが証明できる。また細胞死が確認されるようなら、死につつある細胞の形態をタイムラプス撮影でその様子を観察する。
また同じ細胞株に対して、TTC7Aをトランスジーンで供給すると細胞死が防がれることが証明できれば、TTC7AとTTC7Bの機能的冗長性が証明される。
また内在性のTTC7Bの増強により細胞死が確認されなければ、GIDIDにおけるTTC7A欠損を補償できる可能性を示唆し、パラログの発現増強による遺伝子治療に基礎的な概念実証を与えるものと考えられる。
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