オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

• 研究課題/領域番号: 22K08900
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分55020:消化器外科学関連
• 研究機関: 和歌山県立医科大学
• 研究代表者: 速水 晋也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (00468290)
• 研究分担者: 上野 昌樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90405465) ; 宮本 篤 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00756570) ; 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 学長特命教員(特別顧問) (20191190)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: 肝内胆管癌 / SMYD2 / リンパ節転移 / CRISPR/Cas9 / メチル化 / オルガノイド / メチル基転移酵素

研究開始時の研究の概要

肝内胆管癌は予後不良であり、リンパ節転移は強い予後不良因子だが、診断に用いられている現代のモダリティでは限界がある。本研究では第一に、肝内胆管癌転移リンパ節で高発現していたメチル化酵素SMYD2（SET and MYND domain containing 2）による転移メカニズムを、胆管癌オルガノイドを用いて明らかにする。第二にSMYD2をターゲットとしてcirculating cell-free tumor DNA（ctDNA）の発現をモニタリングし、肝内胆管癌リンパ節転移の非侵襲的検査方法を開発する。これにより、適切な手術適応決定・術前/術後化学療法の最適な使用につながる。

研究実績の概要

①オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認し、本実験系の構築が成立した。
② SMYD2阻害剤LLY-507を用いて臨床実装に近いSMYD2抑制実験を行った。まず実験系におけるLLY-507の指摘濃度を決定した。LLY-507を決定した適性濃度で処置し、免疫化学染色で確認する。
③確立したSMYD2抑制系を用いて、EMT関連タンパク抗体を用いた免疫化学染色を行い、SMYD2抑制によってどの分子の変動があるか、つまりSMYD2の下流に存在する分子の検討を以下の抗体で行った：TGF-β1/VEGFC/N-cadherin/E-cadherin/β-actin。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画通り、研究が進んでいるため。

今後の研究の推進方策

当初予定した通り実験計画を進める。