オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

• 研究課題/領域番号: 22K08900
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分55020:消化器外科学関連
• 研究機関: 和歌山県立医科大学
• 研究代表者: 速水 晋也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (00468290)
• 研究分担者: 上野 昌樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90405465) ; 宮本 篤 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00756570) ; 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 学長特命教員(特別顧問) (20191190)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: 肝内胆管癌 / SMYD2 / メチル化 / オルガノイド / CRISPR/Cas9 / メチル基転移酵素

研究開始時の研究の概要

肝内胆管癌は予後不良であり、リンパ節転移は強い予後不良因子だが、診断に用いられている現代のモダリティでは限界がある。本研究では第一に、肝内胆管癌転移リンパ節で高発現していたメチル化酵素SMYD2（SET and MYND domain containing 2）による転移メカニズムを、胆管癌オルガノイドを用いて明らかにする。第二にSMYD2をターゲットとしてcirculating cell-free tumor DNA（ctDNA）の発現をモニタリングし、肝内胆管癌リンパ節転移の非侵襲的検査方法を開発する。これにより、適切な手術適応決定・術前/術後化学療法の最適な使用につながる。

研究実績の概要

i) 胆管癌オルガノイドの樹立
がんオルガノイド「F-PDO」の胆管癌由来RBIL001-2 (F_PDO_000012) を用いて、F-PDOプロトコールに則り、専用の培養液Cancer Cell Expansion Media plus（032-25745, 富士フイルム和光純薬）にて継代、3D立体構造を確認した。
ii) オルガノイドSMYD2発現解析－免疫化学染色
樹立培養したRBIL001-2におけるSMYD2発現解析として免疫化学染色を行った。抗SMYD2抗体（mouse monoclonal, sc-393827; Santa Cruz Biotechnology）および二次抗体Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594; ab150116, abcam)を使用、当大学に設置されている 共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZEISS Confocal Laser Scanning Microscope Model LSM780）にて観察した。
iii) SMYD2抑制系実験システムの構築：CRISPR/Cas9によるSMYD2抑制系の構築
オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)（sc-403129; Santa Cruz Biotechnology）を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定・計画通り研究を遂行できている。

今後の研究の推進方策

当初の計画書通り研究を進める。