| 研究課題/領域番号 |
22K09186
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分55060:救急医学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
川井 廉之 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90445073)
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| 研究分担者 |
中山 章文 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 教授 (70536721)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | 敗血症 / 迅速診断 / 16SrRNA / PCR |
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| 研究開始時の研究の概要 |
敗血症の治療において、適切な抗菌薬を1時間以内に投与することは極めて重要である。しかし、現在この課題に対応可能な検査法は開発されていない。申請者はこれまでに血液検体から直接細菌DNAを検出するために細菌DNAを特異的に増幅するPCR法の開発を行ってきた。本申請課題では、敗血症患者の検体から直接細菌DNAを特異的に増幅する技術を、超高速PCR装置に導入することで、極めて短時間で血液検体から直接細菌DNAを特異的に増幅する検査法を確立することで、臨床現場に敗血症原因菌の情報を提供することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
敗血症の原因菌の同定には現在の検出方法では迅速性に欠ける。現在の実用化されている検出方法では、細菌の増殖能に依存した培養による前処理が必要であることがある。さらに敗血症症例から得られた血液サンプルから迅速に原因菌を分子生物学的アプローチによって同定できない理由の一つは原因菌のDNA量と比較して、圧倒的多数存在するヒト遺伝子由来のDNAに対する非特異的反応があげられる。
本研究の目的は、これらの課題を解決し、敗血症患者からえら得た血液サンプルから迅速に原因菌するために、培養による増菌の過程を経ずに、直接原因菌の遺伝子を増幅する手法の確立を行うことである。
我々はこれまでの研究で、ヒトDNAとの非特異的増幅を排除しながら微量に含まれる細菌DNAの増幅が可能となるPCR条件を開発し、特定の細菌に対しては極めて微量のDNAであっても非特異的増幅を排除した細菌DNAの増幅を確認した。一方、この実験条件では一部の細菌DNAに対する増幅効率には課題が見いだされた。そこで、敗血症治療において臨床上問題となる原因菌を広く同定することが可能となるように、in silicoの実験で増幅効率が不良な菌種のDNA配列の確認と改善を進めてきた。現在、多様な細菌に対して効率よく増幅可能なプライマーの候補に対して、ヒトDNAとの非特異的増幅の排除が可能となるように、個々の実験条件のチューニングと検証を進めている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
増幅効率を高めることで、新たに試薬中の極めて微量のDNAとの非特異的反応が問題となった。これに対しては、PCR反応開始前に試薬中のDNAを分解することによって、解決出来る見込みである。
さらに、すでに開発済みのプライマーをin silicoの実験でより広い範囲の細菌DNA配列に対応可能となるように見直しを進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
すでに開発済みのプライマーをin silicoの実験で臨床上課題となる、より多様な細菌DNAを効率よく増幅できるよう改善する。
上記プライマーの開発によって、ヒトDNAとの非特異的反応の排除を確認する。
実験的にヒトDNAと細菌DNAの混合検体で、細菌DNAを特異的に効率よく増幅できることを確認する。
敗血症臨床血液検体から、細菌DNAの増幅とシーケンス解析による細菌同定によって同定された細菌種と血液培養検査で同定された菌種との比較検証を行う。
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