| 研究課題/領域番号 |
22K09237
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56010:脳神経外科学関連
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
水口 麻子 宮崎大学, 安全衛生保健センター, 講師 (00647472)
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| 研究分担者 |
横上 聖貴 宮崎大学, 医学部, 准教授 (40284856)
山下 真治 宮崎大学, 医学部, 助教 (40468046)
渡邉 孝 宮崎大学, 医学部, 講師 (90573337)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2026年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2025年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
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| キーワード | EVI1 / PDGFRｂ / 血管新生 / TKR / 受容体型チロシンキナーゼ / 悪性神経膠腫 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脳神経外科で保有するグリオブラストーマ培養細胞株を用いて、PDGFRβの発現量を評価し、以降の実験に適した細胞株を選定する。次に、複数のグリオブラストーマ培養細胞株を用いてEVI1の発現変動を行い、PDGFRβおよびその下流に存在する分子、血管新生における主要分子について、発現量の変化を解析する。さらに、PDGFRβのプロモーターアッセイを行い、EVI1によるPDGFRβの発現制御において必須の領域を同定する。また、グリオブラストーマの組織切片からレーザーマイクロダイセクション法を用いて微小血管増殖部分を切り出し、EVI1のmRNA発現量について同一腫瘍の他の部位と比較する。
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| 研究実績の概要 |
①グリオブラストーマ培養細胞株（A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1）を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRｂ、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。
②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目（コンフルエンシーは約3-4割）にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類（ニッポンジーン社製およびThermosientific社製）使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRｂ、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。
③PEGFRｂおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48～72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナ感染症に対する対応で多忙であった事、また、県外移動の規制もあり、学会発表による報告は行っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の実験結果から、EVI1はPDGFRbおよびVEGFR1に対し、正の遺伝子発現制御を行っていると推測している。一方、EVI1の発現上昇に伴い、これらの遺伝子発現が増加するかどうかについては未確認であり、この課題に沿って実験を推進する。EVI1の強制発現用ベクターは保有しているが、このベクターによる強制発現では、EVI1のmRNAは数万倍にまで発現上昇をきたす。生体内では、悪性神経膠腫患者において、このようなEVI1の極端な発現上昇が起きているとは考え難い。そのため、もっと生理的な条件に近い環境で、EVI1の発現上昇が起きる条件について検討中である。
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