小胞体ストレスがテモゾロミドに及ぼす影響

研究課題

研究課題/領域番号	22K09253
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分56010:脳神経外科学関連
研究機関	岐阜大学
研究代表者	庄田健二岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (00866981)
研究分担者	岩間亨岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (20303498) 大江直行岐阜大学, 医学部附属病院, 准教授 (60362159) 山田哲也岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60816114) 木下喬公岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (40866977) 熊谷昌紀岐阜大学, 医学部附属病院, 医員 (50973369)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円) 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
キーワード	小胞体ストレス / テモゾロミド耐性 / 抗腫瘍作用 / 神経膠芽腫
研究開始時の研究の概要	GBMは、化学療法薬剤であるテモゾロミドへの耐性をもつことで抗腫瘍効果を減弱させる。本研究では小胞体(ER)ストレスとテモゾロミド耐性の関係に注目した。ERは細胞内においてタンパク質の合成や分泌、貯蔵を行う。しかし遺伝子変異や低栄養、低酸素、感染などの刺激により変性タンパク質が生じ、これらがERに蓄積することでERストレスが発生し、ストレスに対する反応(UPR)が起きる。UPRによりelF2が活性化され、テモゾロミド耐性が増強される。本研究ではelF2阻害剤である ISRIBがテモゾロミド耐性を減弱させ抗腫瘍作用を増強するかを検討する。
研究実績の概要	我々は複数の神経膠芽腫（GBM；Glioblastoma)の細胞株（U251、U87、T98G）において、細胞生存試験でElongation factor 2 (elF2)阻害剤であるIntegrated stress response inhibitor (ISRIB)がテモゾロミドの作用効果を増強することを確認した。GBMは遺伝子多型であることが知られているが、異なる細胞株でも併用効果を発揮することが判明し、遺伝子変異が症例ごとで異なる実臨床においても、有用となりうる可能性が考えられた。またelF2は小胞体ストレスによってリン酸化されるが、ウエスタンブロッティングにより、ISRIBの投与がGBM細胞株のelF2のリン酸化が阻害されることを確認した。これによりISRIBがGBMの小胞体ストレスによる反応を阻害していると考えられた。今後は投与時間によるelF2のリン酸化の変化を評価し、作用が最も増強する時間を評価する予定である。小胞体ストレスによって生じるActivating transcription factor (ATF)4が腫瘍血管の新生を促すことで腫瘍の増殖を促進させ、さらにテモゾロミドの抗腫瘍効果を減弱させることが報告されている。elF2のリン酸化もATF4を活性化させるとされ、ISRIBの投与によるATF4およびATF4によって発現が増加する抗酸化応答因子の変化を評価している。また当研究室においてはマウスのGBM細胞株(GL261)を使用したGBM移植マウスモデルの作成手技は確立しており、そのモデルを使用した論文を発表している。今後はIn vivoにおいてISRIBの作用効果を検討する予定であり、現在投与量および投与方法を検討中である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 ISRIBの併用がテモゾロミドの作用効果を増強することは、In vitroにおける細胞生存試験に証明することができ、また作用機序の検討も行うことができた。細胞増殖や細胞死の評価においては、既に関連するウエスタンブロッティングの抗体も購入して検討を行っている。現在細胞増殖の阻害および細胞死がどの時間帯で生じるかを投与時間ごとに分けたサンプルを用いて検討している段階である。またsiRNA、shRNAによるノックダウンの検討においては現在購入する試薬を検討中であり、試薬を購入後にテモゾロミドとの併用効果の検討を予定している。
今後の研究の推進方策	今後はISRIBの投与によるelF2の減少が、GBM細胞に与えるシグナルの変化を評価する予定である。また小胞体ストレスにより産生されるストレス顆粒も酸化ストレスやテモゾロミドに対する耐性を引き起こすと報告されており、ISRIBの投与がストレス顆粒を抑制するかを評価する。なおin vitroのデータをもと至適な薬剤量、投与時間のプロトコルが作成できたら、マウスモデルを使用してテモゾロミドとの併用効果を検討する予定である。