| 研究課題/領域番号 |
22K09304
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56020:整形外科学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
三島 健一 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (40646519)
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| 研究分担者 |
鬼頭 浩史 あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室), 臨床研究室, 副センター長 (40291174)
松下 雅樹 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (60721115)
神谷 庸成 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (50845542)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 骨壊死 / Runx2 / 骨形成促進薬 / 線維化 / de novo創薬 / ペルテス病 / 化合物ライブラリー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ペルテス病では、壊死骨が吸収されると線維性組織に置換されるため、新生骨の添加は遅延し力学的強度の低下が遷延する。不可逆的な骨頭変形を予防するには、骨吸収の抑制に加えて骨形成を促す強力な刺激と壊死組織の「線維化」を抑制する必要があると考えられる。本研究の目標は、骨壊死という難治性の病態を克服するため、大規模低・中分子化合物ライブラリーを使ったde novo創薬によって強力な骨再生促進薬を開発することと骨壊死領域に形成される線維性組織の分子生物学的な特徴を明らかにし、近年開発研究が進んでいる抗線維化治療の応用可能性を探ることである。
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| 研究実績の概要 |
今期はTLR4拮抗薬であるLPS-RSの虚血性骨壊死に対する効果を調べた。実験はマウスの大腿骨遠位顆部を栄養する主要な血管4本を顕微鏡にて同定し、これらをすべて凝固焼灼して虚血性骨壊死を誘導する動物モデルを使用して行った。馴化した12週齢のC57BL/6雄マウスの左後肢に上記の手術操作を施し、術翌日から週に2回、4週間、LPS-RS 5 mg/kg (薬剤投与群)およびVehicle（対照群）の腹腔内投与を行った。実験中に削痩や脱毛を生じることはなかった。術後2、4、６週で安楽死させ、左後肢から膝関節を残したまま大腿骨と脛骨を採取し、HE染色やTRAP染色による組織学的評価やマイクロCTによる形態学的評価を行った。
術後2週時点では、壊死骨端における骨梁内empty lacunaeの個数には両群間に有意差を認めなかった。マイクロCTで定量評価した壊死骨端内の海綿骨の骨密度にも有意差はみられなかった。一方、薬剤投与群の方が組織学的には壊死骨端内の破骨細胞数は多い傾向がみられた。最終評価では術後6週時点では、壊死骨端の圧潰度に明らかな違いは確認されなかった。
Runx2は未分化間葉系細胞からの骨芽細胞分化に必須の転写因子である。今期はRunx2の発現や転写活性化能を上昇させ、骨芽細胞分化や骨形成を促進させ得る化合物スクリーニングを開始した。ヒトRunx2遺伝子の骨芽細胞分化に関わるP1プロモーター領域をサブクローニングしたルシフェラーゼベクターを安定発現する未分化間葉系細胞株を樹立し、スクリーニングを行った。一次スクリーニングには名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所 (ITbM)から供与を受けた800種類の基本骨格化合物を使用した。3回試行を行ったところ、16種類の化合物はランソプラゾールよりも高いプロモーター活性を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度もコロナ禍によって年度当初は実験手技をサポートしてくれる実験助手や大学院生の活動時間の減少が続き、研究の進捗に少なからず影響した。感染の流行が落ち着き、TLR4拮抗薬単独の効果検証は開始できたが、当初の予定である複数種の薬剤を投与する実験系は実施できていない。また1次スクリーニングで同定された16種類の化合物の実際の効果を検証する実験系は実施できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
来期もマウス大腿骨顆部虚血性骨壊死モデルを使用し、TLR4拮抗薬単独あるいは水溶性ランソプラゾールとの併用投与による壊死骨の圧壊抑制効果を検証していく。今期の動物実験では壊死骨の骨代謝回転がTLR4拮抗薬によって亢進される可能性を示唆する結果が得られたが、骨端の圧潰抑制効果までは確認できなかった。そこでさらに用量あるいは投与回数を増やすこと（連日または隔日で１日複数回投与）によって骨端の圧潰予防が可能かどうかを検証する。また水溶性ランソプラゾール8 mg/kg/day投与群では、骨端の骨形成促進効果が確認できているため、骨壊死誘導後３週までの早期にTLR4の全身投与を行い、その後水溶性ランソプラゾールに切り換えさらに3週間全身投与を行う実験も予定している。
1次スクリーニングで同定された16種類の化合物の薬効を検証するため、細胞実験でRunx2の遺伝子や蛋白発現の定量評価、転写活性化能の評価、骨芽細胞分化の評価を予定している。
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