| 研究課題/領域番号 |
22K09419
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56020:整形外科学関連
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
榎本 光裕 東京医科歯科大学, 東京医科歯科大学病院, 非常勤講師 (90451971)
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| 研究分担者 |
辻 邦和 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, ジョイントリサーチ講座教授 (20323694)
平井 高志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40510350)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / 後根神経節 / ニューロン / グリア |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究の学術的な問いは、「神経損傷後に起こる後根神経節（DRG）での神経細胞死と衛星細胞（サテライトグリア:SGC）の関与が疼痛慢性化に寄与するか」である。損傷後、経時的な神経細胞死は過去に報告されているもののSGCとの関与について報告はない。グリアはギャップ結合を介して過剰なグルタミン酸を緩衝し、神経活動を調整しているが、慢性疼痛下でSGCでのギャップ結合の役割は不明である。本研究では神経障害性疼痛モデルを用いてin vitroでDRGニューロン・グリア細胞連関でのギャップ結合発現プロファイルを作成し、慢性疼痛下で一次求心性ニューロンに対する新規治療法の基盤となる研究を行う。
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| 研究実績の概要 |
神経損傷後に起こる後根神経節（DRG）での神経細胞（ニューロン）死と衛星細胞（サテライトグリア）の関与が疼痛慢性化にどのように寄与するかをテーマに研究を実施している。今年度は、野生型マウスC57BL/6、Sox10-Venus マウスを入手し、脛骨神経と総腓骨神経を切断し腓腹神経を温存したspared nerve injury（SNI）モデルを作製した。C57BL/6マウスのSNIモデル作製後、1週、3週、6週で灌流固定し、第3(L3)、第4腰部(L4)DRGを単離し、組織学的に蛍光免疫染色を実施した。小型ペプチドニューロンに対して抗calcitonin gene-related peptide (CGRP)、非ペプチドニューロンに対して抗Isolectin B4 (IB4)抗体を用いて陽性細胞数を計測した。正常マウスDRGの陽性数を100%とした。
L3DRGのCGRP陽性割合は、損傷1週69%、3週76%、6週65%であった。L4DRGでは、1週122%、3週110%、6週109%であった。L3DRGのIB4陽性割合は、損傷1週75%、3週76%、6週70%であった。L4DRGでは、1週74%、3週78%、6週75%であった。L4DRGのCGRP陽性細胞数は損傷急性期に増加、維持しており、IB4陽性細胞はL3、L4DRGともに低下していた。
マウス坐骨神経損傷後の場合、L5DRGでCGRP陽性細胞が増加することが報告(Fukui et al. J Orthop Res 2010)されている。SNIモデルでも非ペプチドニューロンよりCGRPを伝達物質とした小型ペプチドニューロンの役割が大きいと考えられた。また、SNIモデルではL3DRGよりL4DRGでの関与が高く、L4DRGの変化を指標に解析を進めていく必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子改変マウスの準備は終了している。グリア細胞が蛍光ラベルされているSox10-Venus マウスの飼育、繁殖は順調で神経障害性モデルを作製して行動解析、組織学的解析をすすめている。一方、in vitroでのコネキシン発現プロファイルの作成に関してFACSでのDRG細胞ソーティングの設定に時間を要している。Sox10-Venus マウスDRGからの細胞単離、FACSによる細胞ソーティングはできたが、回収細胞数が少なかった。細胞単離のための酵素を複数テストし、酵素反応時間の検討を行っている。また、疼痛モデルマウスの匹数を増やしてFACSソーティングを行う予定としている。現時点で細胞からのRNA抽出は可能であるが、RNA収量が低い状態である。
腰部DRGでのニューロンサブタイプの同定とSGCの局在に関しては、順調に解析が進められている。神経障害性疼痛モデルのDRGではL4DRGの関与が大きく、その中でCGRP陽性小型ニューロンの増加が明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験に使用するSox10-Venus マウスの系統維持を動物実験施設で継続的に実施する。
前年度実施途中のコネキシン発現プロファイルの作成を行う。Sox10-Venus マウスを使用し、SNI損傷後3、6週でL4DRGを単離して患側と健側にわける。蛍光標識されたサテライトグリア細胞をソーティングする。ソーティング後にRNAを回収して健側と患側で比較することでコネキシン発現プロファイルを作成する。さらに培養技術を用いてDRGニューロンと共培養することでプロファイルの変化を健側、患側由来細胞で比較する。また、組織学的に腰部DRGでのギャップ結合発現やグルタミン酸輸送体の検索を行う。これら分子の局在を解析することで慢性疼痛環境下にあるDRGニューロン、サテライトグリアの相互作用を明らかにする予定である。SNI後の腰部DRGニューロンサブタイプの同定に関しては、ある程度成果がまとまったため学会発表を行う予定としている。
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