脂肪由来幹細胞を用いた骨関節感染症治療用バイオインプラントの開発

• 研究課題/領域番号: 22K09420
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56020:整形外科学関連
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 林 克洋 金沢大学, 保健学系, 教授 (80507054)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
• キーワード: 脂肪由来幹細胞 / ヨード担持酸化チタン / バイオインプラント / ヨード担持加工 / 感染

研究開始時の研究の概要

本研究は、骨関節疾患の手術に使用するインプラントの感染耐性をあげ、感染の治療にも直接使用でき、かつ再生医療として骨再生能力の高い新規バイオインプラントを開発、臨床応用へとつなげることである。この開発により整形外科手術全般を劇的にかえ得ることになり、術後感染の撲滅、インプラント周囲の骨再生の促進により早期リハビリ、社会復帰など、高齢社会への健康寿命、歩行能力の維持への貢献が大いに期待される。

研究実績の概要

インプラントの感染耐性をあげ、感染の治療にも直接使用でき、かつ骨再生能力の高い新規バイオインプラントを開発、臨床応用を目的とした実験を計画した。我々の開発した抗菌作用ヨードを担持したチタンに感染耐性かつ骨再生能力のある幹細胞を付加することで、感染抵抗性バイオインプラントの開発を行うこととした。純チタンと今回使用予定のチタン64合金にヨード担持加工を施し、担持量は十分担保されているのを確認、多孔質構造を持つチタン製トライタニウムでも、多孔面と平面で適切なヨード担持が確認された。これらの金属上で脂肪由来幹細胞（ADSC）の培養と生着の確認を行った。まずインプラントが幹細胞に対して毒性が無いか確認するため、βTCP人工骨、トラベキュラータンタル、ヨード担持酸化チタンとADSCの共培養を行い、Cell Counting Kit-8(450nm)にて細胞数を確認した。いずれの条件でも細胞毒性は認められず、インプラントの使用は問題ないと判断した。
多孔質構造をもつインプラント表面での細胞の接着性をみるため、トラベキュラータンタルと、ヨード担持酸化チタン上でADSCを7日間培養し、クリスタルバイオレッド染色で観察した。いずれも多孔質構造の深部まで細胞が分布しているのが観察できた。
次に、最終的なバイオインプラントは細胞の厚みを要するので、培養細胞から、スフェロイドを重合させた幹細胞塊をインプラント表面に接着させることとした。そのままインプラント表面に細胞塊を配置して培養すると、1日で細胞塊が凝集して均一に覆わなかった。培養条件や細胞塊密度などを変更し模索したところ、細胞塊の上からPETクロスにて圧着させることで凝集を防ぐことに成功した。インプラント側面からも細胞塊が深部まで入り込んでいることが確認できた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

バイオインプラントの幹となる多孔質チタンの選定および、ヨード担持に成功しており、その表面での細胞毒性の無いことが確認された。細胞の培養および、細胞塊で表面加工することも実現し開発は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

抗菌、感染治療効果のある幹細胞とヨード担持チタンハイブリッドのバイオインプラントを作成し、動物実験で安全性と治療効果の証明を行い、臨床応用への橋渡しを計画する。そのため、金属表面での幹細胞の培養、スフェロイド構造体の固着を切片病理観察することで金属深部への固着などの確認を要する。それらの結果をもとに培養プロトコールの確定、細菌接着阻害や感染抵抗性バイオフィルムの確認をし、最終的に動物実験で感染抵抗、治療効果、骨親和性、強度、安全性の確認を行う。
金属内への細胞接着をみるため、ホルマリン固定した後、メタクリル酸メチルで包理し、研磨標本での組織学的評価を行い、細胞の親和性を明らかにする。更に、脂肪由来幹細胞をシプロフロキサシン含有培養液で培養して得られる抗生剤徐放性細胞でも同様にバイオインプラントを作成し、バイオインプラントの作成条件を明らかにする予定である。
その後、バイオインプラントの細菌接着阻害やバイオフィルムの確認、動物実験でバイオインプラントの感染抵抗、骨親和性、初期強度、安全性の確認をすすめていく。並行して幹細胞の再生力や殺菌作用を増強させる培養プロトコールや添加物質なども研究していく。

研究成果

• [雑誌論文] Chondroprotective Effects of Chondrogenic Differentiated Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Sheet on Degenerated Articular Cartilage in an Experimental Rabbit Model (2023)
  • 著者名/発表者名: Taninaka Atsushi、Kabata Tamon、Hayashi Katsuhiro、Kajino Yoshitomo、Inoue Daisuke、Ohmori Takaaki、Ueoka Ken、Yamamuro Yuki、Kataoka Tomoyuki、Saiki Yoshitomo、Yanagi Yu、Ima Musashi、Iyobe Takahiro、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Bioengineering 巻: 10 号: 5 ページ: 574-574
  • DOI: 10.3390/bioengineering10050574
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Antibacterial effect and biological reaction of calcium phosphate cement impregnated with iodine for use in bone defects (2023)
  • 著者名/発表者名: Morinaga Sei、Yamamoto Norio、Tokoro Masaharu、Hayashi Katsuhiro、Takeuchi Akihiko、Miwa Shinji、Igarashi Kentaro、Taniguchi Yuta、Asano Yohei、Nojima Takayuki、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Journal of Biomaterials Applications 巻: 37 号: 10 ページ: 1716-1723
  • DOI: 10.1177/08853282231164827
  • 査読あり
• [雑誌論文] Graft Survivals after Reconstruction Using Tumor-Bearing Frozen Bone in the Extremities (2023)
  • 著者名/発表者名: Miwa Shinji、Yamamoto Norio、Hayashi Katsuhiro、Takeuchi Akihiko、Igarashi Kentaro、Bangcoy Martin Louie S.、Taniguchi Yuta、Morinaga Sei、Asano Yohei、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Cancers 巻: 15 号: 15 ページ: 3926-3926
  • DOI: 10.3390/cancers15153926
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A validation study for the utility of serum microRNA as a diagnostic and prognostic marker in patients with osteosarcoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Araki, Naofumi Asano, Norio Yamamoto, Katsuhiro Hayashi, Akihiko Takeuchi, Shinji Miwa, Kentaro Igarashi, Takashi Higuchi, Kensaku Abe, Yuta Taniguchi, Hirotaka Yonezawa, Sei Morinaga, Yohei Asano, Takeshi Yoshida, Rikinari Hanayama, Juntaro Matsuzaki, Takahiro Ochiya, Akira Kawai, Hiroyuki Tsuchiya
  • 雑誌名: Oncology Letters 巻: 25(6); 222 号: 6 ページ: 222-222
  • DOI: 10.3892/ol.2023.13808
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Bone Regeneration Using Autologous Adipose-Derived Stem Cell Spheroid Complex (2022)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Hayashi, Xang Fang, Hiroshi Ueda, Akihiro Miwa, Toshiaki Naka
  • 雑誌名: J. Biomater. Tissue Eng 巻: 12 号: 6 ページ: 1216-1223
  • DOI: 10.1166/jbt.2022.3014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Surgical Site Infection after Bone Tumor Surgery: Risk Factors and New Preventive Techniques (2022)
  • 著者名/発表者名: Miwa Shinji、Yamamoto Norio、Hayashi Katsuhiro、Takeuchi Akihiko、Igarashi Kentaro、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Cancers 巻: 14 号: 18 ページ: 4527-4527
  • DOI: 10.3390/cancers14184527
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 小児多骨性線維性骨異形成に対する手術療法の臨床経過 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林克洋
  • 学会等名: 第34回日本小児整形外科学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Bone regeneration using autologous adipose-derived stem cell spheroid complex (2023)
  • 著者名/発表者名: Hayashi K, Yamamoto N, Takeuchi A, Miwa S, Igrashi K, Taniguchi Y, Morinaga S, Asano Y, Tsuchiya H
  • 学会等名: American Academy of Orthopaedic Surgeons
  • 国際学会
• [学会発表] In vitro and in vivo experiment of bone regeneration after tumor resection using autologous adipose-derived stem cell spheroid complex (2022)
  • 著者名/発表者名: Hayashi K, Yamamoto N, Takeuchi A, Miwa S, Igrashi K, Taniguchi Y, Morinaga S, Asano Y, Tsuchiya H
  • 学会等名: ISOLS
  • 国際学会