| 研究課題/領域番号 |
22K09481
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56030:泌尿器科学関連
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
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| 研究分担者 |
加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (00620931)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063)
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 再生医療 / 腎 / ES細胞 / FACS / ネフロン / 尿路 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
Pax2遺伝子を導入したES細胞を分化させることで近位尿細管マーカーのAQP1陽性細胞となることが確認できた。本研究では、このPax2遺伝子導入ES細胞を分化させ、SclやVEGFなどの血管形成因子発現した多段階においてAQP1やCD31などのマーカーでFACSを行うことで未分化な細胞を除去し、糸球体や尿細管、血管への分化が進む状態にする。またWnt6やdHANDの存在下で尿路上皮や平滑筋細胞への分化を確認し、VimentinやACTA2などのマーカーでFACSを行う。これらの細胞で3次元培養を行い、腎尿路の類似構造をとるかを確認できたら、さらにマウス成体、特に腎臓に移植することで立体構造を持った腎組織へ分化し、生着できることを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。今後他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、こ標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初期段階の細胞分化の確認はできたものの、他の培養条件での遺伝子発現が確認できていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、追加された知見を取り入れながら、培養条件決定を継続する。
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