機能的な構造を有する腎・尿路再生への選択的細胞抽出法を応用した基礎的研究

• 研究課題/領域番号: 22K09481
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56030:泌尿器科学関連
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
• 研究分担者: 加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931) ; 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 再生医療 / 腎 / ES細胞 / FACS / ネフロン / 尿路

研究開始時の研究の概要

Pax2遺伝子を導入したES細胞を分化させることで近位尿細管マーカーのAQP1陽性細胞となることが確認できた。本研究では、このPax2遺伝子導入ES細胞を分化させ、SclやVEGFなどの血管形成因子発現した多段階においてAQP1やCD31などのマーカーでFACSを行うことで未分化な細胞を除去し、糸球体や尿細管、血管への分化が進む状態にする。またWnt6やdHANDの存在下で尿路上皮や平滑筋細胞への分化を確認し、VimentinやACTA2などのマーカーでFACSを行う。これらの細胞で3次元培養を行い、腎尿路の類似構造をとるかを確認できたら、さらにマウス成体、特に腎臓に移植することで立体構造を持った腎組織へ分化し、生着できることを明らかにする。

研究実績の概要

遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養 し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに 5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、 2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝 子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、 Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを 行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。さらに、Podcinが上昇した条件での培養細胞からFACSを行い、目的の細胞が得られているか確認中である。今後、さらに他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

初期段階の細胞分化の確認はできたものの、目的となる細胞の発現遺伝子は確認や候補の選定に時間を要しており、他の培養条件での遺伝子発現が確認することが必要であるため。

今後の研究の推進方策

引き続き、追加された知見を取り入れながら、培養条件決定を継続する。