内耳細胞死由来エクソソーム・DAMPsが海馬の空間情報処理に及ぼす影響の解明

• 研究課題/領域番号: 22K09674
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56050:耳鼻咽喉科学関連
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 林 賢 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (80534528)
• 研究分担者: 高島 明彦 学習院大学, 理学部, 教授 (00154774) ; 神崎 晶 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 室長 (50286556)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: NaAsO2 / Nucleophagy / cGAS-STING / LaminB1 / 内耳細胞老化 / オートファジー / SASP / 酸化ストレス / 内耳細胞死 / エクソソーム / DAMPs / 老化ミクログリア

研究開始時の研究の概要

本研究の目的は、細胞死を起こした内耳有毛細胞から分泌されるexo-mRNAとDAMPsが、ボトムアップシグナルとして嗅内野-海馬の時空間認識・記憶のネットワークに及ぼす影響と老化ミクログリアからの老化シグナル解析を行い、認知症プレクリニカル期のバイオマーカーを発見し、認知症予防を目的とした新規治療薬を開発することである。

研究実績の概要

時空間認識能・記憶に直接的に影響する脳内炎症の発症には、老化細胞の蓄積と慢性炎症が深く関与することが明らかになってきた。内耳培養細胞HEI-OC1を酸化ストレス誘導剤NaAsO2で曝露し実験を行った。NaAsO2曝露内耳細胞において、細胞増殖率は抑制されるが、死細胞数は増加しない条件（NaAsO2 0-72h, 250-500μM）を内耳細胞老化モデルの処理条件として、核内γH2AXフォーカス形成の有意な増加、SA-βgal陽性細胞数の有意な増加、SASP関連遺伝子の有意な発現上昇といった複数の老化表現型を確認し、NaAsO2曝露による酸化ストレス誘導性内耳細胞老化モデルを確立した。NaAsO2曝露内耳細胞の核周囲にLAMP1陽性のDNA断片を認めた。この結果は、核周囲に漏出したクロマチン断片に対して、nucleophagyによる細胞内クロマチン断片の細胞内消化が不十分な状態であることを示している。透過型電子顕微鏡下のNaAsO2暴露24h後の内耳細胞において、核膜の穿孔と、クロマチン断片漏出、エンドソーム、未熟なオートファゴソームの核周囲への集積を認めた。Lamin B1陽性のAggregates, BudsタイプとLamin B1陰性のSpecklesタイプを核周囲に認めた。一方、Lamin B1の核分画は、時間依存性に発現低下を認めた。この結果は、NaAsO2曝露内耳老化細胞において、核膜が損傷し、クロマチンが漏出している可能性を示唆している。Western blotによるタンパク質レベルでの発現解析において、cGASは発現増加したが、逆にSTINGは発現低下した。NaAsO2曝露によるLaminB1の発現低下と細胞質内に漏出するクロマチン断片によるcGAS活性化は、内耳細胞老化とSASPの誘導に深く関与する可能性を示唆している

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

HEI-OC1細胞は、温度感受性細胞であり、癌細胞や線維芽細胞とは異なり、やや培養の安定管理が難しく、生存率や増殖率の安定に時間を要し、研究結果が安定するまで時間を要したことが最大要因である。

今後の研究の推進方策

亜ヒ酸ナトリウム（NaAsO2）曝露HEI-OC1細胞とコントロール細胞の培養液から分離抽出したエクソソームを、理研ジェネシスの受託サービスによるexo-miRNAの発現解析を行い、亜ヒ酸ナトリウム（NaAsO2）曝露による酸化ストレス誘導性内耳細胞老化に重要な役割を果たすexo-miRNAのプロファイリングを行う。cGAS KO細胞とLaminB1 KO 細胞を作製し、cGAS とLaminB1が分解型・分泌型nuclear autophagy (Nucleophagy)の誘導と内耳細胞老化に与える影響について検討する。さらに、処理細胞の培養液をELISA法によって細胞老化分泌形質（SASP）の発現解析を行う。プロファイリングした exo-miRNAから分解型・分泌型nuclear autophagy (Nucleophagy)の誘導と内耳細胞老化に関与するmiRNAを選定し、海馬神経初代培養細胞とミクログリア培養細胞に付加する。透過型電子顕微鏡下(TEM)にて、エクソソソーム表面マーカーCD81 の金コロイド染色を行い、エクソソソームが、海馬神経細胞とミクログリアに取り込まれるか否かを確認する。オートファジープローブ (Kaizuka T, Molecular Cell, 2016)を海馬神経培養細胞に導入し、オートファジー 分解能と細胞老化誘導の関係を評価する。分解型・分泌型nucleophagy解析を行う。新規 DAMPs を探索する目的にて、酸化ストレス・小胞体ストレス暴露細胞の RNA シー クエンス解析(理研ジェネシス)を行い、ダイイング・エイジングメッセージ遺伝子発現解析を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Fine-tuned cholesterol solubilizer, mono-6-O-α-D-maltosyl-γ-cyclodextrin, ameliorates experimental Niemann–Pick disease type C without hearing loss (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamada Y, Miwa T, Nakashima M, Shirakawa A, Ishii A, Namba N, Kondo Y, Takeo T, Nakagata N, Motoyama K, Higashi T, Arima H, Kurauchi Y, Seki T, Katsuki H, Okada Y, Ichikawa A, Higaki K, Hayashi K, Minami K, Yoshikawa N, Ikeda R, Ishikawa Y, Kajii T, Tachii K, Takeda H, Orita Y, Matsuo M, Irie T, Ishitsuka Y
  • 雑誌名: Biomedicine & Pharmacotherapy 巻: 155 ページ: 113698-113698
  • DOI: 10.1016/j.biopha.2022.113698
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] TFEB活性低下とリソソーム損傷が内耳細胞老化に及ぼす影響 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林 賢、五島史行、野村泰之、鴨頭輝，藤本千里
  • 学会等名: 第124回日本耳鼻咽喉科頭頸部外科学会総会・学術講演会 第3群 耳研究1
• [学会発表] 酸化ストレス誘導性内耳細胞老化におけるTFEBを焦点としたオートファジー・リソソーム経路制御機構の解明 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林 賢、鈴木 佑奈、槇島 誠
  • 学会等名: 第23回日本抗加齢医学会総会 一般口演10 「細胞基礎 / 細胞臨床」
• [学会発表] TFEB,オートファジー・リソソーム経路, 細胞内ROS間のクロストークによる内耳細胞老化制御 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林 賢、五島史行、野村泰之、鴨頭輝，藤本千里
  • 学会等名: 第33回 日本耳科学会総会・学術講演会 第15群 基礎2 第５会場
• [学会発表] Exosomal miRNA let-7b modulates the interaction between TLR7 and TRPA1, inducing hyperexcitability-induced cell death in auditory cell (2022)
  • 著者名/発表者名: Ken Hayashi, Hideaki Sakata
  • 学会等名: 49th Congress of the Neurootological and equillibriometric society
  • 国際学会
• [学会発表] The functions of exosomal miRNA let-7b as a top-down signal disrupting the neural network in the auditory-brain (2022)
  • 著者名/発表者名: Ken Hayashi, Hideaki Sakata
  • 学会等名: 49th Congress of the Neurootological and equillibriometric society
  • 国際学会
• [学会発表] TFEBによるオートファジー・リソソーム経路活性化を介した内耳細胞老化制御メカニズムの解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 林 賢
  • 学会等名: 第32回 日本耳科学会 総会・学術講演会
  • 招待講演