| 研究課題/領域番号 |
22K09749
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56050:耳鼻咽喉科学関連
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
山下 拓 北里大学, 医学部, 教授 (00296683)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | CD109 / REV7 / ノックアウトマウス / 癌細胞株 / バイオマーカー / ノックアウト / 癌細胞雄株 / 頭頸部癌 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、TGF-β1シグナル伝達抑制因子であるCD109発現の頭頸部扁平上皮癌での意義を評価するため、（１）頭頸部癌の予後バイオマーカーとしての有用性、（２）放射線治療感受性バイオマーカーとしてのCD109発現の有用性、（３）CD109の頭頸部扁平上皮癌に対する治療標的としての有用性、の3点を明らかにすることを目的とする。具体的には、頭頸部癌患者の組織標本を用いた免疫組織化学染色の評価、in vitroでのCD109ノックダウンの化学療法・放射線治療に対する治療感受性への効果の評価、in vivoでのCD109siRNA投与による化学療法・放射線治療に対する治療感受性への効果の評価を行う。
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| 研究実績の概要 |
北里大学病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科で診断治療を行った中咽頭扁平上皮癌患者の摘出ないし生検の臨床検体を用いてp16およびCD109免疫染色を行った。その結果、p16陽性中咽頭扁平上皮癌の症例グループにおいてCD109陽性群はCD109陰性群と比較し有意に無増悪生存率が不良であることを確認した（p < 0.01）。またヒトp16陽性中咽頭癌細胞株においてCD109の強発現が認められることをWestern Blotで確認後、siRNAにてCD109発現をノックダウンしたところ、CD109ノックダウンp16陽性中咽頭癌細胞株では野生株に比較しインベージョンアッセイにおける腫瘍浸潤能の低下がみられることを確認した。ヒトp16陰性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるHSC-3およびFaDu、ヒトp16陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるUM-SCC-47およびUM-SCC-104を用い、シスプラチン感受性の検討に適切な細胞播種濃度およびシスプラチン濃度の条件を検討した。この条件検討はCD109ノックアウトによるシスプラチンに対する感受性の変化を今後検討するために必要である。また、上記の4種類の細胞株を用い、CRISPR-Cas9システムによる遺伝子導入、遺伝子導入に必要なプラスミド精製、遺伝子導入した細胞のセレクション、遺伝子導入した細胞のノックアウト効果検証に必要な条件検討および手技取得をそれぞれ行っている。現時点ではFaDuに対してリポフェクタミン試薬を用いたプラスミド法によるREV7のノックアウトとピューロマイシン耐性遺伝子導入を利用したセレクションの条件検討が達成できている。また、UM-SCC-47に対してはセレクションの条件検討が昨年度終了した。CD109のノックアウトの条件検討も並行して進めている。REV7のノックアウトに用いるプラスミドを精製するための大腸菌ノックアウトベクターは当大学の病理学教室が所有しているものを使用しているが、ノックアウトベクター作成および精製したプラスミドのシーケンス確認に関する手技を取得した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
HSC-3，FaDu、UM-SCC-47，UM-SCC-104の4種のヒト頭頸部扁平上皮癌細胞株に対するノックアウトの条件や適切なセレクション方法の検討にいまだ難渋している。リポフェクタミン試薬を用いた遺伝子導入以外に、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の検討も行ったが少なくともFaDuに対しては不適当な方法であった。また、ピューロマイシン耐性遺伝子ではなく緑色蛍光蛋白質を用いたセレクションが適当であるか検討するため、緑色蛍光蛋白質を含むプラスミドも新しく精製してFaDuおよびHSC-3に導入し、セルソーターを用いてセレクションを行ったがこの方法も不適当であった。FaDuと同様にUM-SCC-47に対してもリポフェクタミン試薬を用いたプラスミド法によるREV7のノックアウトとピューロマイシン耐性遺伝子導入を利用したセレクションを行っており、セレクションの条件検討のみ終了しているが、現時点ではREV7をノックアウトしたUM-SCC-47の細胞株を回収できていない。CD109のノックアウトに用いるプラスミドの精製も並行して進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
FaDu、UM-SCC-47以外の2種類の細胞株（HSC-3，UM-SCC-104）の遺伝子導入およびセレクションの条件検討を引き続き進める。並行してCD109のノックアウトのための大腸菌ノックアウトベクター作成を行う．その後にCD109のノックアウト細胞株を樹立させ、シスプラチンに対する感受性の変化を検討する予定である。さらにCD109ノックアウト頭頸部癌細胞株、REV7ノックアウト頭頸部癌細胞雄株を作成することで、これらの因子の腫瘍増殖、腫瘍浸潤、化学療法や放射線治療感受性への関与について明らかにし、治療ターゲットとしての可能性を検討する予定である。
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