唾液エキソソームによるリキッドバイオプシーを可能とするFRETセンサーの開発

• 研究課題/領域番号: 22K09944
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分57020:病態系口腔科学関連
• 研究機関: 北海道医療大学
• 研究代表者: 仙葉 愼吾 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (40466496)
• 研究分担者: 谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149) ; 根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (00305913)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 中途終了 (2022年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円); 2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: 唾液エキソソーム / リキッドバイオプシー / FRETセンサー / エキソソーム / 唾液 / FRET

研究開始時の研究の概要

本申請では、唾液中のエクソソームに含まれるタンパク質やmiRNAを検出し、唾液検体を用いたリキッドバイオプシーを可能とする簡易センサーを開発することを目的とする。そのために、①scFvによる抗原抗体反応を用いた新たなFRET分子センサーの開発、②DNA-RNA hybridizationによる二次構造の変化に起因するFRET強度の変化を利用した、miRNAを検出するセンサーの開発、③これらのセンサーを高容量COOH不織布に結合させた担体を用いた簡易検査キットを作成し、ヒト唾液に被験物質を混合した模擬検体を用いた機能評価を行う。

研究実績の概要

本申請では、唾液中のエクソソームに含まれる特異的なタンパク質やmiRNAを検出することでがんの早期診断を可能とするFRETセンサーの開発を目的とする。唾液は簡便かつ大量に採取可能な検体であり、がん組織由来のエクソソームが含まれていることが報告されているが、唾液中のエクソソームを用いた簡便なリキッドバイオプシーは確立していない。本申請では、唾液中のムチンなどの粘液成分や夾雑タンパク質を除去しエクソソームを効率よく濃縮する方法と、センサー分子の構造変化による蛍光変化で被験物質の結合を検知する新しいFRETセンサー（CD81センサーとmiRNAセンサー）を開発する。これらの技術を組み合わせ、唾液検体中のエクソソーム由来の生体物質の検出を試みる。
（１）唾液前処理法の開発：性質の異なる複数種類のフィルターを使って、唾液に含まれるムチンをはじめとする夾雑物を除去する前処理法を開発した。サンプルとして唾液原液（原液）、処理液Aで1/3希釈した唾液（1/3唾液）、処理液Aで1/10希釈した唾液を用いた（1/10唾液）。ムチンの除去の可否はPAS染色で検討した。その結果、フィルターAがムチンを通過させないことが明らかになった。
（２）エクソソーム濃縮法の開発：レンチウイルスを用いて、マーカーとなる膜タンパク質を持つ擬似エクソソーム（PsEX）を作成した。これを唾液に混ぜたものを模擬サンプルとし、さまざまなフィルターを通過させ、フィルターに吸着したPsEX由来の膜タンパク質をウェスタンブロットで検出した。その結果、フィルターBにPsEXがある程度吸着することが明らかとなった。フィルターBの材質、PsEXの吸着様式を明らかにすることでさらに高効率にエクソソームを吸着・濃縮できるものと期待される。