| 研究課題/領域番号 |
22K09948
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57020:病態系口腔科学関連
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| 研究機関 | 明海大学 |
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研究代表者 |
坂東 健二郎 明海大学, 歯学部, 教授 (50347093)
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| 研究分担者 |
福田 正勝 明海大学, 歯学部, 講師 (10311614)
友村 明人 明海大学, 歯学部, 名誉教授 (60188810)
藤本 健吾 明海大学, 歯学部, 講師 (90286013)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | TREM2 / sTREM2 / マクロファージ / LPS / CXCL10 / CXCL11 / macrophage / exosome |
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| 研究開始時の研究の概要 |
CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集により Trem2 遺伝子の KO を行ってきたが、その過程で、TREM2 の細胞内ドメインを欠く分泌型 TREM2 様のバリアントを発現する細胞が得られた。この細胞では Trem2 を siRNA でノックダウンした細胞と LPS の応答性に違いが見られた。こうした経緯から、CRISPR/Cas9 を用いて複数の TREM2 バリアント発現細胞を作成し、TREM2 のマクロファージと破骨細胞への多様な生理的作用を解析し、さらに歯周病や MRONJ のような骨免疫学的な疾患の病態メカニズムの解明を目指すことを目的とした研究を計画した。
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| 研究実績の概要 |
マクロファージをLPSで刺激した際の応答についてTREM2が関与しているかどうかを確認するため、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞のTREM2をsiRNAによりノックダウンし、LPS刺激後2時間後のおよそ30種類のケモカインの遺伝子発現を確認した。すると、Ccl2、Ccl4、Ccl5、Cxcl10、Cxcl11の発現がTrem2遺伝子ノックダウンにより、抑制された。この結果から、これらのケモカイン遺伝子のLPSによる誘導にはTREM2が関与していると考えられる。
次に、細胞膜上に発現しているTREM2と培地中に遊離しているsoluble TREM2 (sTREM2)をフローサイトメトリーとELISAによって解析したところ、マクロファージの細胞膜上にあるTREM2は恒常的に培地中に遊離しており、24時間で約4 ng/mLに達していた。また、RAW264.7細胞をLPS刺激すると、細胞膜上のTREM2は急速に減少し、培地中に遊離することも判明した。これらの結果から、培地中に遊離したsTREM2もマクロファージのLPSによるケモカイン誘導に関わっているのではないかと考えた。
RAW264.7細胞のTrem2遺伝子をsiRNAでノックダウンし、LPS刺激時にrecombinant sTREM2 (rsTREM2)を培地に添加したところ、Ccl2、Ccl4、Ccl5の発現はrsTREM2に影響を受けなかったが、Trem2のノックダウンで抑制されたCxcl10とCxcl11の発現はrsTREM2添加により一部、回復した。
これらの結果は、マクロファージのLPS刺激時に、一部のケモカインの発現にTREM2が関与しており、Cxcl10とCxcl11の発現については遊離型のsTREM2を介していることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
siRNAを使った実験で、マクロファージが恒常的に遊離しているsTREM2が一部のケモカインの発現を仲介していることを示唆する結果が得られた。また、CRISPR/Cas9システムを使い、RAW264.7細胞のTrem2 KO細胞やTREM2 バリアント発現細胞のクローニングを進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度からクローニングを進めている TREM2 バリアント発現細胞（一部または全部）を LPS により刺激し、発現が誘導される遺伝子が TREM2 の有無に影響されるかを網羅的に検討を行う。とくに、前年度のsiRNAを使った実験で発現に差があった遺伝子を中心にリアルタイム PCR 法などで確認し、タンパク質の発現をウエスタンブロット法や ELISA 法、Flow cytometry で確認する。また、Trem2 遺伝子の変異による影響を受ける遺伝子群に共通の細胞内シグナル経路を検索し、その経路のシグナル分子の活性化をウエスタンブロット法などで確認する。また、前年度に作成した Trem2 KO RAW264.7 細胞に TREM2 と sTREM2の Dox (Doxycycline) inducible 発現ベクターを導入する事で、TREM2 と sTREM2 の発現を on/off できる細胞を作成する。
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