| 研究課題/領域番号 |
22K10147
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
新谷 智章 広島大学, 病院(歯), 講師 (90403518)
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| 研究分担者 |
岡本 哲治 東亜大学, その他の研究科, 教授 (00169153)
檜垣 美雷 広島大学, 病院(歯), 助教 (40826856)
林堂 安貴 広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 遺伝子編集 / HBp17/FGFBP / 扁平上皮細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
Heparin-binding protein 17/FGF-Binding Protein (HBp17/FGFBP)は、A431細胞の培養上清よりFGF-2とともに分離・精製した、ヘパリン親和性分泌蛋白であり、上皮細胞で特異的に発現していた。
CRISPR/CASシステムを用いて、HBp17/FGFBP遺伝子をknockout (KO) したA431細胞および正常扁平上皮細胞を作成する。コントロール細胞に比べ、腫瘍増殖、細胞運動能や造腫瘍性を調べる。両細胞の発現分子の網羅的解析を行う。
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| 研究実績の概要 |
Heparin-binding protein 17/FGF-Binding Protein (HBp17/FGFBP)は、研究分担者の岡本らが、A431細胞の培養上清よりFGF-2とともに分離・精製した、ヘパリン親和性分泌蛋白であり、上皮細胞で特異的に発現していた（Wu DQ et. al. J Biol Chem. 1991）。造腫瘍性を欠失しHBp17/FGFBP遺伝子を発現していないA431の亜株である#4クローンにHBp17/FGFBPを発現させると、in vitroでの増殖能はA431#4細胞に比べ著しく亢進し、ヌードマウス背部皮下における造腫瘍性を獲得したED-71もしくはエタノールを添加したA431細胞の培養上清中のexosomeに含まれるmicroRNA (miRNA)をそれぞれ抽出後、miRNAマイクロアレイ解析にてmiRNA発現の網羅的解析を行なった。HBp17/FGFBP mRNAを標的とするmiR候補を検索した結果、ED-71により発現が上昇するexosomal miRNAとして、miR-6887-5pを同定した。miR-6887-5p mimicを用いてmiR-6887-5pを過剰発現させたSCC/OSCC細胞では、コントロールと比較してHBp17/FGFBP-1の発現抑制を認めた。miR-6887-5p mimicを導入したSCC/OSCC細胞ではコントロールに比べin vitro/in vivoにおける有意な増殖抑制効果を認めた。CRISPR／CASシステムを用いて、A431細胞のHBp17/FGFBP遺伝子発現をノックアウトした、A431ーHBp17KO細胞を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
CRISPR／CASシステムを用いて、A431細胞のHBp17/FGFBP遺伝子発現をノックアウトした、A431ーHBp17KO細胞を構築したが、A431細胞への遺伝子導入効率が悪く、リポフェクション法だけでなくエレクトロポレーション法も試したために時間を予定より多く要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
A431ーHBp17KO細胞とParent細胞から蛋白とRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ法とプロテオミクスによるアッセイを行い、2つの細胞の遺伝子と蛋白の発現の違いを確認する。
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