研究課題
基盤研究(C)
インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培地（hESF9）を用いて誘導したCCD-iPSCに対し、CRISPR /Cas9システムにて変異遺伝子のゲノム手術を行う。それらCCD-iPSCに無血清培養条件で様々な増殖因子や阻害因子を加え上皮系・間葉系細胞・軟骨組織にそれぞれ分化誘導を行う。さらにそれらをin vitro、in vivoで共培養し組織学的検討、蛋白・遺伝子発現の検討を行い、疾患モデルとしての有用性を検討、病態解明に挑む。
過剰歯は臨床において高頻度に遭遇するが、その発症メカニズムは未だ明らかでない。鎖骨頭蓋異形成症（CCD）は多数の埋伏過剰歯を発症する遺伝性顎顔面疾患であり、CCDの病態解明は、遺伝性疾患以外の過剰歯の病態解明、ひいては歯の再生研究の発展に貢献するものと考えられる。一方、疾患特異的iPS細胞（iPSC）は、疾患の発症に関する病原変異遺伝子の情報を有し、病態解明・治療法の開発への貢献が期待される。これまで申請者らはiPSC誘導・培養法に関わる様々なリスクの排除を目指し、インテグレーション・フィーダーフリー、無血清培養条件でのiPSC誘導・培養法を確立し、種々の遺伝性顎顔面疾患患者細胞からiPSCを樹立してきた。本研究では、その病態解明を目的として、我々が既に樹立したCCD由来iPSCを用い、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムで病原変異遺伝子修復後に分化誘導を行い、近年その有用性が注目されるシングルセルRNA-seq解析を用い病態モデル作製に挑もうとするものである。研究実績としては、ゲノム編集は条件検討中であるが、CCDの責任遺伝子であるRUNX2が転写因子として働く軟骨細胞を罹患組織としてターゲットを絞り、病態モデルとしての軟骨分化誘導を検討し、無血清培養条件下での軟骨分化誘導法を確立しており、現在、その解析を進めている。
2: おおむね順調に進展している
CCD-iPSCsとWT-iPSCそれぞれより分化誘導された軟骨細胞においては、CCD-iPSCsの方が軟骨基質の産生が少ないことが安定して示され、病態の一部を再現できた可能性があると考えている。
対象とするiPSCのゲノム編集不耐の問題が未解決あり、現段階では厳密な疾患と健常の比較が困難である。次年度は、早急にゲノム編集を成功させ、残りの研究期間で、引き続きiPSC分化誘導、シングルセルRNA-seq解析を行い、過剰歯発生メカニズムを明らかにする。
すべて 2023 2022 2021
すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (16件) (うち国際学会 4件)
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