研究課題
基盤研究(C)
インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培地(hESF9)を用いて誘導したCCD-iPSCに対し、CRISPR /Cas9システムにて変異遺伝子のゲノム手術を行う。それらCCD-iPSCに無血清培養条件で様々な増殖因子や阻害因子を加え上皮系・間葉系細胞・軟骨組織にそれぞれ分化誘導を行う。さらにそれらをin vitro、in vivoで共培養し組織学的検討、蛋白・遺伝子発現の検討を行い、疾患モデルとしての有用性を検討、病態解明に挑む。
過剰歯は臨床において高頻度に遭遇するが、その発症メカニズムは未だ明らかでない。鎖骨頭蓋異形成症(CCD)は多数の埋伏過剰歯を発症する遺伝性顎顔面疾患であり、CCDの病態解明は、遺伝性疾患以外の過剰歯の病態解明、ひいては歯の再生研究の発展に貢献するものと考えられる。一方、疾患特異的iPS細胞(iPSC)は、疾患の発症に関する病原変異遺伝子の情報を有し、病態解明・治療法の開発への貢献が期待される。これまで申請者らはiPSC誘導・培養法に関わる様々なリスクの排除を目指し、インテグレーション・フィーダーフリー、無血清培養条件でのiPSC誘導・培養法を確立し、種々の遺伝性顎顔面疾患患者細胞からiPSCを樹立してきた。本研究では、その病態解明を目的として、我々が既に樹立したCCD由来iPSCを用い、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムで病原変異遺伝子修復後に分化誘導を行い、近年その有用性が注目されるシングルセルRNA-seq解析を用い病態モデル作製に挑もうとするものである。研究実績としては、ゲノム編集は条件検討中であるが、その責任遺伝子であるRUNX2が転写因子として働く軟骨細胞を罹患組織としてターゲットを絞り、病態モデルとしての軟骨分化誘導は進めている。CCD-iPSCsとWT-iPSCそれぞれより分化誘導された軟骨細胞においては、CCD-iPSCsの方が軟骨基質の産生が少ないことが示され病態の一部を再現できた可能性があると考えられる。
3: やや遅れている
病態モデルとしての軟骨細胞分化の条件検討は整いつつあるが、その前段階であるゲノム編集をCRISPER-Cas9システムで検討しているが、標的であるRUNX2変異の修復に至っていない。
CRISPER-Cas9システムの中で、gRNAが細胞内でRNaseにさらされて分解している可能性が考えられる。今後は、より強いRNase耐性力を持つgRNAで再挑戦する計画である。
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